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β-细辛醚对缺糖缺氧PC12细胞自噬的影响

莫镇涛  
【摘要】:目的: 1.研究PC12细胞在缺糖缺氧(2h)再给氧过程中ATP与Beclin-1的相关性。 2.研究自噬在PC12细胞缺糖缺氧(2h)再给氧过程中的的作用。 3.研究β-细辛醚对缺糖缺氧再给氧PC12细胞Beclin-1、线粒体膜电位(MMP)、细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)、细胞成活率、细胞形态的影响。 方法: 1.建立缺糖缺氧再给氧PC12细胞损伤模型:将高糖DMEM完全培养液换为无糖的Earle's平衡盐溶液,并将培养板放入1%O2、94%N2和5%CO2的培养箱培养2h,作为模拟细胞缺糖缺氧的状态,然后弃Earle's平衡盐溶液并换回高糖DMEM完全培养液,并将培养板放入5%CO2的培养箱培养模拟再给氧状态。 2.建立高效液相(HPLC)检测ATP的方法学:通过设置阴性对照组,标准品对照组,样品对照组,考察细胞提取液ATP检测的专属性;精密称取10.0mgATP并用双蒸水溶解定容至10mL。精密量取以上1.00mg/mL ATP标准液0.5mL定容至10mL,浓度即为50.0μg/mL。依次精密量取50.0μg/mL ATP标准液16、32、48、64、80μL并用双蒸水定容至10mL,浓度依次为0.080、0.160、0.240、0.320、0.400ng/mL。进样器精密吸取20μL进样。在0.080-0.400mg/mL范围内,考察ATP浓度与峰面积的线性关系;取0.080、0.240、0.400μg的低、中、高三种不同的ATP对照品溶液各一份,连续进样五次,考察精密度;取再给氧0、10、24h3个不同时点的细胞各5份,分别加入600μL PBS重悬,然后加入80μL50%的HCl04-80℃/室温反复冻融2次,分别加入0.1、0.2、0.4μg/mLATP标准溶液1mL,再用300μL,2mol/LNaOH将细胞提取液的pH值调至中性,4℃12000r/min离心15min,取上清液进行测定,考察平均回收率。将处理后的再给氧24h的细胞提取液于-80℃放置Od、3d、7d检测,考察样品储存的稳定性。 3.建立流式细胞仪检测Beclin-1的方法学:包括考察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA),2%牛血清的PBS封闭液,一抗的浓度(0.002、0.004、0.006μg/μL孵育温度(25、37℃),孵育时间(15、30、60min),保存方法及时间(标本标记制备后立即检测和4℃放置6h、24h上机检测;或用1%多聚甲醛固定后4℃保存放置1、3、7d检测)对Beclin-1蛋白测定的影响。 4.研究自噬的作用及自噬与ATP关系。体外培养PC12细胞48h,弃细胞完全培养液,PBS洗一遍后,加入Earle's平衡盐溶液并放入1%O2、94%N2和5%CO2的培养箱中培养2h,然后弃Earle's平衡盐溶液并换回细胞完全培养液培养0,4,10,24,,18h,HPLC检测ATP(并检测24h的正常对照组ATP),BCA法检测蛋白含量,流式细胞仪检测Beclin-1,MTT法检测细胞活力,倒置相差显微镜下观察细胞形态。透射电子显微镜下观察正常培养PC12细胞与再给氧24h PC12细胞的自噬体数量和形态。将同一孔的再给氧0、24h的细胞分别分成两份,一份用于检测ATP含量,另一份用于检测Beclin-1表达,并做两者的相关性分析。 13-细辛醚对缺糖缺氧再给氧PC12细胞自噬的影响:体外培养PC12细胞48后,分别用含β-细辛醚(20、30、45μg/mL),尼莫地平(10μmol/L)的细胞完全培养液预给药1h后,弃药液,PBS洗1遍,分别加入含β-细辛醚(20、30、45μg/mL)、尼莫地平(10μmol/L)的Earle's平衡盐溶液并放入1%02、94%N2和5%CO2的培养箱中培养2h,然后弃Earle's平衡盐溶液并换回细胞完全培养液培养24小时,流式细胞仪检测Beclin-1,MMP,[Ca2+]i,MTT法检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞数量和形态,透射电子显微镜观察自噬体。 6.统计分析方法:数据以均数±标准差(x±s)表示,采用独立样本t检测法检测组间的差异性和Pearson相关性分析法分析两指标之间的相关性。 结果: 1.在0.08-0.40mg/mL范围内,ATP浓度与峰面积有良好的线性关系(r=0.9995);连续测定5次0.080,0.240,0.400μg/mL ATP的峰面积,RSD分别为2.8、2.1、1.8%,精密度良好;测得再给氧0、10、24h3个不同时点细胞提取液的平均回收率为95.6±2.8%,RSD为2.9%,准确度良好;-80℃冰箱储存0,3,7d,ATP浓度分别为0.331±0.010,0.312±0.012,0.303±0.008μg/mL,RSD为4.5%,储存7天内稳定性良好。 2.正常细胞的Beclin-1表达很低(6.49±1.19%),但缺糖缺氧再给氧后,Beclin-1表达显著升高(33.14±2.16%)。自噬抑制剂3-MA能够显著降低模型组Beclin-1表达(15.27±1.51%vs模型组,P0.001)。标本标记过程中使用2%BSA/PBS与不使2%BSA/PBS测得的Beclin-1表达率分别是35.40±2.13%和43.99±7.26%,两者有统计学差异(P0.01)一抗浓度为0.004μg/μL时,测得的Beclin-1表达率最高(35.40±2.13%),一抗浓度为0.002、0.006时,测得的Beclin-1表达率均所下降(分别为33.54±2.27%,29.95±1.76%);抗体孵育温度在室温(25℃)和37℃水浴时,测得的Beclin-1表达率无显著性差异(36.27±3.29%vs36.70±2.84%6,P0.05);孵育时间30min、60min检测结果无统计学差异(36.38±3.51%vs36.36±3.64%,P0.05),但孵育时间15min时,测得的Beclin-1表达率有所降低(31.67±3.76%vs36.38±3.51%,P0.05);标本制备后立即检测和放置于4℃保存6h检测结果无显著性差异(36.30±3.29%vs34.93±3.38%,P0.05),但4℃保存24h检测结果明显下降(20.81±3.99%vs36.30±3.29%,P0.001);标记制备后的标本固定在1%多聚甲醛中并置放于4℃可保存3天其检测结果与当天检测的结果无显著性差异(36.59±3.19%vs37.67±3.38%,P0.05),第7天检测结果则明显下降。(24.04±3.83%vs37.67±3.38%,P0.001)。 3.PC12细胞缺糖缺氧2h再给氧期间,细胞成活率、细胞ATP含量先降低后升高,Beclin-1表达先升高后降低,细胞形态的变化是先损伤后改善。PC12细胞缺糖缺氧2h,再给氧0、4、10h,细胞成活率持续下降(64.6±4.6%、51.8±1.6%、36.0±5.6%),再给氧24、48h细胞成活率持续上升(56.8±3.7%、73.4±4.3%)。再给氧0、4h细胞ATP含量持续下降(3.4±0.5、3.2±0.4mg/g蛋白),10h有所恢复(4.1±0.7mg/g蛋白),但是仍低于缺氧前水平(4.6±0.9mg/g蛋白),再给氧24、48h,细胞ATP含量持续升高(5.4±0.9、6.7±1.2mg/g蛋白)。再给氧24h细胞ATP含量显著低于正常对照组(5.4±0.9mg/g蛋白vs7.7±1.2mg/g蛋白,p0.001)。再给氧0、4、10、24,48h,Beclin-1蛋白表达上调(10.5±1.4%、12.7±1.4%、16.1±1.8%、28.2±3.1%、20.0±3.2%),再给氧48h与再给氧24h相比,Beclin-1蛋白表达下调。再给氧0、4、10h,细胞数量持续减少,并在10h时减少至最低值,突起变短,细胞变圆变小,皱缩聚集。再给氧24h,细胞数量增加,胞体变得较为饱满,轴突变长。再给氧48h,细胞数量增加,胞体变得饱满,突起相互交织形成网状。正常培养的细胞较难观察到自噬体,再给氧24h的细胞可明显观察到一些自噬体。再给氧0h,ATP与Beclin-1呈显著负相关关系(r=-0.61,P0.05),再给氧24h,ATP与Beclin-1没有显著相关性(r=0.24,P0.05)。 4.体外正常培养48h的PC12细胞缺糖缺氧2h,再给氧24h后,在光镜下可观察到细胞数量减少,胞体变圆,轴突变细长;在电镜下能够明显观察到一些自噬体;Beclin-1表达显著增加(28.5±2.3%,vs正常组(6.3±0.8%),p0.001),OD值显著降低(0.46±0.02,vs正常组(0.79±0.04),p0.001);MMP显著降低(335.2±19.3,vs正常组(542.5±26.6),p0.001);[Ca2+]i显著升高(294.9±42.7,vs正常组(124.7±14.9),p0.001)。β-细辛醚(20,30,45μg/mL)和尼莫地平(10μmol/L)都非常显著地降低模型组细胞Beclin-1表达(19.1±2.8%、17.6±2.6%、20.5±2.8%、15.6±2.5%,vs模型组,p0.001)和[Ca2+]i(137.8±23.5、132.4±25.5、169.7±23.9、139.0±19.0,vs模型组p0.001),升高模型组细胞的OD值(0.64±0.07,0.75±0.09,0.56±0.08,0.74±0.04,vs模型组,p0.01)和MMP(422.4±27.5,478.7±21.6,414.1±25.1,483.5±28.2,vs模型组,p0.01),并且不同程度地增加造模细胞数量,改善细胞形态。其中β-细辛醚(30μg/mL)使模型组细胞的活力和[Ca2+]i接近于正常组水平(P0.05)。 结论: 1.使用终浓度约为6%的HCLO_4反复冻融细胞2次能够较好的提取细胞内ATP。HPLC能够分离细胞内的复杂成分,并且快速、准确定量分析细胞内ATP含量。 2.流式细胞仪和透射电子显微镜的研究结果表明,缺糖缺氧再给氧使PC12细胞自噬表达增加。流式细胞仪能够简便、快速、准确地定量细胞Beclin-1的相对百分含量。筛选分析结果表明,优化的流式细胞仪检测Beclin-1蛋白的参数是:标记过程中使用2%牛血清的PBS封闭液;一抗浓度为0.004μg/μL;孵育温度室温(25℃),孵育时间30min;标记制备后标本立即检测或置4℃保存6h内检测,否则要固定在1%多聚甲醛并于4℃保存,3天内检测。 3.PC12细胞缺糖缺氧期间升高的自噬与能量代谢障碍有关,再给氧期间升高的自噬与[Ca2+]i、降低的MMP有关。自噬在2h缺糖缺氧再给氧期间可能起到细胞保护的作用。 4.20、30、45μg/mL的p-细辛醚预给药1h,缺糖缺氧期间给药2h,能不同程度地减轻缺糖缺氧再给氧造成的细胞损伤,其中以30μg/mL的β-细辛醚效果最佳。p-细辛醚可能通过钙离子拮抗作用,改善细胞功能,从而降低自噬,提高细胞成活率。


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