铁皮石斛良种繁育与GAP种植关键技术研究

【摘要】：目的： 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生型草本植物,为我国传统的名贵中草药,具有益胃生津、滋阴清热等功效。现代药理研究表明铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用,因此在临床、中药复方和保健品中被广泛应用。为满足我国药品和保健市场对铁皮石斛的需求,更好地保护和发展铁皮石斛野生资源,将野生铁皮石斛变为家种,开展良种繁育及栽培技术研究,建立规范化种植(GAP)基地是保障铁皮石斛资源可持续利用的重要举措。 近年来铁皮石斛组培苗工厂化生产亦趋于成熟,主要运用组织培养技术来进行无菌播种繁育,其具有繁殖系数高、去病毒、生产不受季节限制等优点,但试管苗生产周期长、易发生变异,生产上对培养基中激素成分无严格控制,且继代次数过多会出现生存力及产量下降,因此有必要建立铁皮石斛高效离体再生繁育体系,从有性繁育及无性繁育途径对试管苗生长进行有效控制,生产出健壮、生长一致的优良种苗。此外,由于铁皮石斛试管苗的组培生产操作繁杂、成本高,不便于贮藏和运输等,人工种子技术的诞生为珍稀紧缺的铁皮石斛药材产业化生产提供了一条新的途径,且纳米Ti02材料有一定的激素效应和抑菌作用,利用其制作铁皮石斛人工种子的复合胚乳和人工种皮,有望能改善传统包埋的透气性、保水性,减少萌发过程中的污染情况,提高人工种子的萌发率和成苗率,从而为铁皮石斛人工种子实用化和产业化发展提供技术支持,并通过规模化应用快速繁育铁皮石斛优良种质。 目前铁皮石斛工业化生产主要通过无菌种子播种模式,种子经原球茎繁育得到大量的试管苗,但其变异较多、质量参差不齐,种植者仅在乎产量的多少,并不在乎种苗是否优质,而且目前铁皮石斛与石斛属其他植物杂交制种混乱导致种苗的变异程度更大。铁皮石斛优良品种是获得优质药材的根本保证之一,为了获取优质的铁皮石斛药材,因此有必要采用育种手段进行优良品种选育。以离体培养为基础的快速育种技术,包括自发变异与人工诱变方法,可使品种选育工作突破了时间、季节及土地规模的限制,对优良种质的选育具有重要的意义。本研究开展铁皮石斛高效离体繁殖、良种选育及GAP种植技术探索,初步选育出优良品种,且制定标准化生产操作规程(SOP),从而为保障铁皮石斛资源可持续利用奠定重要基础。方法： 本研究开展铁皮石斛高效离体再生繁殖、良种繁育及GAP种植关键技术的研究,具体包括以下方面：(1)在组织培养的基础上,依据不同生长调节剂、有机添加物、纳米材料的特殊激素效应和促生长性能等,探讨其对铁皮石斛高效离体再生繁育体系的影响,其中包括有性繁育与茎段无性繁育两种途径,为缩短试管苗生产周期、减少成本、提高移栽成活率及培育高效、高产的铁皮石斛奠定基础。(2)以纳米材料Ti02构建铁皮石斛人工种子,探讨不同人工种皮基质、是否添加保水剂对人工种子制作的影响,分析不同纳米Ti02浓度、包埋方法、接种培养基、交换时间等对萌发率与转株率的影响,同时运用生物学特征、植物生理学检测人工种子萌发苗的生长状况。(3)采用现代育种技术对铁皮石斛进行离体选择育种,包括自发变异及人工诱变,其中人工诱变方法采用秋水仙素及紫外线辐射诱变,运用生物学特征、细胞学观察及流式细胞技术鉴定多倍体铁皮石斛,初步筛选出铁皮石斛优良品种。(4)对铁皮石斛基地环境质量进行考察,通过离体快繁技术,依据试管苗的生长动态对铁皮石斛试管苗进行质量分级评价；并进行了铁皮石斛种苗的移栽技术、施肥原则、病虫害及防治、采收初加工等方面的GAP种植关键技术研究,初步制定出铁皮石斛标准化生产操作规程(SOP)。结果： 1、铁皮石斛高效离体再生繁育体系 野生铁皮石斛种子接入MS培养基中进行无菌培养,结果显示随着培养时间的增加,种子的萌发度逐渐增加,大小由粉状、芝麻粒状到绿豆状生长,到90d原球茎基本全部分化；较理想的铁皮石斛原球茎增殖培养基为MS+KT2.0mg/L;较理想的铁皮石斛原球茎分化培养基为MS+KT1.0mg/L+NAA0.2mg/L+10%椰乳+0.3%活性炭；较理想的铁皮石斛壮苗生根培养基为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L+20%香蕉汁+硝酸铈20mg/L。综合考虑污染率、发芽率两方面,铁皮石斛茎段灭菌效果最好为消毒后去除叶鞘法；不同产地铁皮石斛茎段诱导侧芽的发芽率与不定芽生长情况存在一定的差异；MS培养基综合加入不同生长调节剂(NAA、6-BA)、纳米材料(Ti02、Si02)与添加物(番薯汁、沙葛汁),并不利于铁皮石斛茎段诱导侧芽；不同来源的铁皮石斛茎段对于培养基加入噻苯隆(TDZ)诱导侧芽的反应存在显著性差异,而同一来源的铁皮石斛茎段对于不同浓度TDZ诱导侧芽的反应无显著性差异。 2、铁皮石斛人工种子研究 铁皮石斛人工种子的制作,人工胚乳以4%海藻酸钠结合2%木薯淀粉为宜；添加1.0g/L保水剂对降低人工种子的失水能力无显著性影响,但可以稍微增加失水后人工种子的复水能力；纳米Ti02溶胶颗粒已达到纳米级,且在溶胶中分布均匀；添加5%纳米Ti02对铁皮石斛人工种子萌发苗的生长具有显著的促进作用；海藻酸钙球法制备铁皮石斛人工种子的效果优于中空海藻酸钙球法；播种于1/2MS培养基的铁皮石斛人工种子效果优于琼脂培养基质；人工胚乳与2%CaCl2交换交换时间为15min为佳；随着加入纳米Ti02的增加,铁皮石斛人工种子萌发苗的根系活力逐渐增加、硝酸还原酶活性逐渐增加、总SOD活力先上升后下降、POD活力逐渐上升、CAT活力逐渐上升、T-AOC活力逐渐上升。 3、铁皮石斛育种技术研究 铁皮石斛二倍体植株的染色体为38条；最佳流式细胞术条件为叶片150mg、Otto提取缓冲液3mL、2000r/min离心8min、PI含量37.5μg/mL、孵化30min。实验室中29种铁皮石斛试管苗在欧氏距离的水平上划分为3类,经流式细胞仪检测发现离体培养自发变异率为41.38%(12/29),四倍体细胞含量均50%。第一类试管苗中有75%植株的四倍体细胞含量70%,植株表现为分蘖数多、茎较粗、叶数多、叶较宽、根数多,符合四倍体植株的形态特点；而第二类试管苗的四倍体细胞含量均50%,植株表现为株高、分蘖数、叶宽、根数中等,叶片与根部较长。通过秋水仙素诱变方法发现,铁皮石斛原球茎经秋水仙素浓度≥0.2%处理≥72h后,铁皮石斛再生苗植株体主要为四倍体细胞,四倍体细胞含量均超过70%；而小芽经秋水仙素浓度≥0.05%处理≥96h后,再生苗植株体主要为四倍体细胞,四倍体细胞含量均超过50%。通过紫外线辐射诱变方法发现,紫外线可以显著促进铁皮石斛原球茎萌发芽的生长,其最佳辐射时间为4min,辐射2-4min对原球茎的膨大作用明显,但紫外线照射距离43cm、辐射10mmin以内对铁皮石斛原球茎无明显的诱变效应。 4、铁皮石斛GAP关键技术研究 本研究建立了铁皮石斛GAP种植关键技术措施,种苗具有成活率高、生长快、产量高等特点。通过铁皮石斛GAP种植技术研究,本基地环境质量标准均符合国家标准,收集不同来源的铁皮石斛种质资源,了解种子无菌播种后生长7-9个月组培苗的生长动态,并初步对铁皮石斛种苗质量分级进行评价,建立了本基地移栽技术、施肥原则、病虫害防治、采收加工等方面的铁皮石斛种植SOP。结论： 在铁皮石斛离体培养形态建成过程中,主要包括有性繁育(无菌种子播种→原球茎增殖→原球茎分化→小芽壮苗与生长)与无性繁育(茎段接种→侧芽诱导→侧芽发育)2种途径,而某些激素(或添加物、纳米材料)对铁皮石斛的某一生长发育阶段能起促进作用,实际上单一激素(或添加物、纳米材料)的浓度效应既受其他激素作用的影响,还取决于本身在特殊作用位点的浓度及植物细胞对它的敏感性。对铁皮石斛整个生长发育过程来说,各种激素(或添加物、纳米材料)起着协同互作的作用。对于实际生产而言,合理地使用激素比例十分重要。 将人工种子技术引入铁皮石斛快繁体系中,以纳米材料构建铁皮石斛人工种子,建立生产周期短、生产成本低的无性繁殖生产体系,从而解决铁皮石斛的商业化生产问题,为铁皮石斛的产业化发展提供技术支撑。探讨铁皮石斛离体选择育种,初步将实验室试管苗分为三大类,采用秋水仙素、紫外线辐射诱变手段初步筛选出铁皮石斛的多倍体植株,但大多为嵌合体,仍需进一步的分离纯化。通过建立铁皮石斛GAP种植关键技术措施,运用离体快繁技术初步形成铁皮石斛良种繁育体系,初步评价了铁皮石斛种苗质量分级,制定了移栽技术、施肥原则、病虫害防治、采收加工等方面的铁皮石斛种植SOP,但均尚需深入研究探讨,确保优质种苗供应生产,以解决大规模生产所需种苗问题。目前铁皮石斛快速繁育技术已基本解决,但良种选育仍未完全解决,优良品种需要品种筛选、移栽种植后申请鉴定,由于时间关系,尚需进一步的探讨与深入研究。