铁皮石斛种质资源的鉴定与评价研究

【摘要】：铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生型草本植物,主要分布于我国云南、广西、广东、贵州、浙江、四川、江西、湖南和台湾等地区。铁皮石斛是我国名贵中药材,始载于《神农本草经》,列为上品,具有滋阴清热,益胃生津之功效。铁皮石斛含有多糖、甘露糖和生物碱等有效成分,具有抗衰老、抗氧化和免疫调节作用。 铁皮石斛种子在自然条件下萌发率极低,生长周期长,加上长期过度采挖等原因,导致我国铁皮石斛种质资源急剧减少,甚至有些产区已濒临灭绝。铁皮石斛分布区域广,生长环境各异,变异类型复杂,导致其质量和产量等良莠不齐,差异较大。从而市场上通常出现铁皮石斛的混淆品或伪品,增加了鉴别和评价铁皮石斛种质资源的难度。目前,在铁皮石斛的鉴定和品质评价方面有一些研究报道,但大多数研究因缺乏代表性的样品来源、研究方法单一以及鉴定和评价指标较少等诸多原因,至今为止尚未提出或制定较为全面可靠的铁皮石斛鉴定和品质评价体系。 本研究利用性状、显微和分子鉴定方法对铁皮石斛变异类型进行鉴定,并从生物学特性、有效成分、营养成分以及共生内生真菌等方面,对不同变异类型铁皮石斛进行分析与评价。通过本研究得到了如下主要结果： (1)根据铁皮石斛种内形态特征的变异情况,共确定了9个变异类型。分别是纺锤粗茎型、青杆细茎型、青杆粗茎型、长杆黑节型、矮杆黑节型、矮杆弯曲型、矮杆粗茎型、紫杆红叶型和红杆红叶型。这些变异类型在茎颜色、形状、大小,节和节间特征,叶片颜色、形状和大小以及花颜色等方面存在差异。 (2)性状特征的分析结果显示,9个变异类型铁皮石斛的茎形状、茎颜色、茎长度、茎直径、节间长度、节显著与否、叶片形状、叶片颜色、叶片长度和宽度、叶片斑点、花颜色、唇瓣斑块颜色等性状特征均存在差异。其中茎形状、颜色和大小,叶片形状和颜色、节显著与否等特征对不同变异类型铁皮石斛具有重要的鉴别价值。 (3)显微鉴定研究结果显示,在铁皮石斛变异类型中,茎角质层和表皮细胞无显著差异,而皮下层细胞直径、皮下层细胞层数、鞘纤维直径、鞘纤维数、维管束直径、单位面积维管束数、韧皮部直径和木质部直径存在较大差异。因此,这些显微特征对不同变异类型铁皮石斛提供一定的鉴别依据。 铁皮石斛二年生茎与三年生茎相比,其皮下层细胞层数、鞘纤维数量、直径以及维管束直径均有所减小。说明随着铁皮石斛的生长年限的增加,铁皮石斛茎中的机械组织和输到组织所占比例逐渐减少,反而薄壁组织的比例会相应地增加。 另外,茎粗壮、较短、肉质和表面具有紫色斑点的铁皮石斛变异类型(如TP1、TP8、TP9等)中的多糖颗粒直径明显大于茎细长、表面紫色斑点较少的变异类型(如TP3、TP5等)。茎粗壮而短、肉质、表面具有紫色斑点等特征是反映优质铁皮石斛种质资源的主要特性。 (4)铁皮石斛ITS序列的分析结果显示,我国9个变异类型铁皮石斛可归为四大类：①TP3、TP4、TP5、TP6、TP8和TP9;②TP1;③TP2;④TP7。铁皮石斛ITS序列的BLAST比对(GenBank)结果显示,不同变异类型铁皮石斛的ITS序列同源性水平达到91%-99%。说明从这些变异类型中获取的高同源性ITS序列可以作为我国铁皮石斛种质资源的鉴别特征和指标。 ITS序列的多态性分析结果显示,不同变异类型铁皮石斛的遗传多态性水平较高,在ITS1区有32个变异位点,5.8S区有30个,ITS2区有33个。这很可能与我国铁皮石斛自然生长环境条件的多样性有密切关系。该结果对我国铁皮石斛核心种质资源的建立提供了重要依据。 (5)从铁皮石斛品质特性的分析结果来看,二年生铁皮石斛茎折干率高于三年生铁皮石斛,说明从产量角度考虑,铁皮石斛的最佳采收期应该是第二年,其中变异类型TP7是优先推广发展的种质。另外,二年生铁皮石斛茎多糖、甘露糖和粗纤维含量通常高于三年生,其中变异类型TP5的多糖含量最高(45.14%),变异类型TP6的甘露糖含量最高(30.42%),变异类型TP1的粗纤维含量最高(15.00%)。二年生铁皮石斛茎石斛碱含量通常高于三年生,其中变异类型TP3的石斛碱含量最高(0.087%)。二年生铁皮石斛茎蛋白质和氨基酸含量通常高于三年生,其中变异类型TP3的蛋白质含量最高(1.12g·100g-1),变异类型TP1的氨基酸含量最高(34.15mg·g-1)。说明从铁皮石斛品质来看,铁皮石斛最佳采收时间应该是第二年,其中较好开发前景的变异类型有TP1、TP3、TP5、TP6和TP7。 从形态特征与铁皮石斛化学成分之间的聚类分析结果显示,茎长度与多糖和甘露糖含量存在一定的相关性,说明茎长度可以作为不同变异类型铁皮石斛品质评价的主要指标。 (6)从9个变异类型铁皮石斛中共分离纯化获得了580株,27种菌落类型的内生真菌。形态学和分子鉴定结果表明,27种菌落类型内生真菌分别隶属于9个属,主要归属于半知菌门和子囊菌门。从9个属内生真菌中选取的18种具有代表性的菌株对铁皮石斛组培苗进行诱导,能够从组培苗根茎叶中重新分离出相同的内生真菌,而对照组未分离出任何真菌,说明该18种菌株与铁皮石斛之间存在共生关系。结果显示,在18种菌株中,对铁皮石斛组培苗的生长发育和有效成分的合成产生影响的内生真菌共有5种,其中菌株L6-226能够有效促进铁皮石斛组培苗的生长发育和多糖含量的提高。糖类成分与内生真菌种类之间尚未发现有明显的相关性,而多糖、甘露糖与氨基酸存在一定的相关性,说明糖类成分的合成或积累很可能与氨基酸的合成或积累有关。 综上所述,本研究课题通过多种鉴定方法的综合应用,优化整合多种鉴定方法的优势,弥补单一鉴定方法的不足,并建立了不同变异类型铁皮石斛的综合鉴定方法。 同时,基于生物量、多糖、甘露糖、粗纤维、生物碱、蛋白质和氨基酸等多种指标,建立了不同变异类型铁皮石斛的品质评价体系,为铁皮石斛种质资源的质量控制提供了实验依据。