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Cocktail探针药物法评价(制)何首乌及其主要成分对CYP450酶活性的影响

欧阳玲玲  
【摘要】:背景:何首乌属于补益类中药,具有"补肝肾、益精血"功效,课题组前期研究发现何首乌炮制前后对肝胆转运蛋白基因的表达有差异,肝脏是体内药物代谢和转化的主要场所,其中包括许多I相和II相药物代谢酶,它们决定着药物代谢与转运水平,与药效的发生、发展有密切联系。本课题预期通过何首乌和黑豆提取液及其主要成分的肝体外代谢研究,阐明生首乌及其炮制品以及主要单体成分与肝药酶CYP450的联系,丰富何首乌的炮制理论及对何首乌和黑豆中主要有效组分的认识,评价药物与代谢酶间的相互作用,预测药物相互作用和指导临床合理用药提供理论依据。目的:1同时测定6种CYP450的底物代谢产物的LC-MS/MS方法建立与验证。2(制)何首乌提取液和黑豆提取液对CYP450酶亚型的影响。3何首乌和黑豆中主要化学成分对CYP450酶亚型活性的影响。方法:1采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)建立同时测定6种CYP450探针底物的相应代谢产物:6-羟基氯唑沙宗(CYP2E1)、4'-羟基双氯酚酸(CYP2C19)、对乙酰氨基酚(CYP1A2)、4'-羟基美芬妥英(CYP2C19)、右啡烷(CYP2D6)、氧化硝苯地平(CYP3A4)的分析方法,并用各探针底物的特异性抑制剂对孵育体系进行验证。2考察生首乌、蒸制首乌、黑豆制首乌提取液和黑豆提取液对CYP450酶亚型的影响,以孵育体系中不同浓度的提取液为实验组与未加提取液的对照组进行比较,测定探针底物经各亚型酶所生成的代谢产物,分析各提取液对酶亚型的影响。3考察(制)何首乌中蒽醌类成分大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-吡喃糖苷、大黄酸、大黄酚,非蒽醌类成分没食子酸、二苯乙烯苷、5-羟甲基糠醛和黑豆中异黄酮类成分成分大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素对6种CYP450酶亚型活性的影响,以孵育体系中加入各单体成分为实验组与未加各成分的为对照组进行比较,测定探针底物经各亚型酶所生成的代谢产物,分析各单体成分对酶亚型的影响,对于抑制作用较强的单体,计算其IC50值。结果:1建立了同时测定体外肝微粒体中该6种探针底物代谢产物的LC-MS/MS方法,该方法操作简便,灵敏度、精密度、准确度高,检测周期短,满足生物样品的分析要求。同时用各亚型酶的特异性抑制剂对反应体系进行验证,为同时评价药物对CYP450主要 6 种酶亚型 CYP2E1、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4 体外代谢活性的影响奠定了方法学基础。2生首乌、蒸制首乌和黑豆制首乌提取液对CYP2E1、CYP2C9、CYP1A2和CYP2D6都有一定程度的抑制作用,且随浓度的增大抑制作用增强;(制)何首乌提取液在10μ g/mL和100 μ g/mL时对CYP3A4酶亚型活性影响不大,而在300 μ g/mL时有明显的抑制作用;蒸制首乌和黑豆制首乌对CYP450酶亚型的抑制作用较生首乌弱;黑豆提取液对CYP2C9和CYP3A4无显著影响;对CYP2E1和CYP2D6有抑制作用;1 μ g/mL对CYP1A2表现抑制作用,10 μ g/mL和200 μ g/mL对CYP1A2有促进作用。3何首乌中蒽醌类化合物,对CYP2E1则表现出抑制作用;对其它几个酶亚型则抑制趋势不一致,但大黄素对CYP2C19表现出强抑制作用,IC5。值为1.43μmol/L;其余化合物对CYP2D6和CYP3A4几乎无抑制作用。何首乌中非蒽醌类成分二苯乙烯苷对CYP2E1、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用外,对其它三种酶亚型没有抑制作用;没食子酸在合适浓度有促进CYP450酶活性趋势;5-羟甲基糠醛对CYP2D6有显著促进作用,对其它5种亚型都没有明显抑制作用。黑豆中的大豆苷、染料木苷在合适浓度对CYP450酶亚型有促进作用,大豆苷元、染料木素对CYP450酶亚型表现不同程度的抑制趋势。结论:Cocktail探针药物组合方法的建立可用于快速评价何首乌和黑豆提取液以及主要单体成分对CYP450酶亚型的影响。生首乌、蒸制首乌、黑豆制首乌和黑豆提取液对CYP450都有一定程度的抑制作用,而蒸制首乌和黑豆制首乌对CYP450的抑制作用较生首乌减弱,表明炮制后的首乌能够降低对CYP450酶活性的影响,这可能是其毒性减弱的机制。黑豆制何首乌对CYP450酶亚型的影响较蒸制首乌有减弱趋势,提示用黑豆炮制何首乌的合理性。何首乌和黑豆中的单体成分对CYP2E1、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19和CYP2D6有一定抑制作用,对CYP3A4无显著影响;炮制后含量增加的游离蒽醌类成分、没食子酸、5-羟甲基糠醛以及含量降低的二苯乙烯苷对CYP450都有一定的影响,表明何首乌炮制前后的药理功效的差异与其成分变化相关。


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