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基于DNA条形码及实时荧光定量PCR技术的燕窝鉴别研究

王凤云  
【摘要】:目的:燕窝(Edible bird's nest, EBN)为雨燕科(Apodidae)金丝燕属(.Aerodramus  Collocalia)多种鸟类分泌唾液筑成的巢窝,主产于东南亚沿海地区。因燕窝属于昂贵珍稀之物,价位等级悬殊,利润丰厚,同时由于缺乏科学的鉴别标准,致使目前市场上燕窝品种质量参差不齐,许多不法商人利用全假或掺假燕窝及其制品谋取暴利的现象十分严重,目前燕窝鉴别的方法和技术虽已有一定的实用性,但专属性和灵敏性还需进一步改进和提高。因此为规范市场和合理开发使用,亟需对燕窝进行系统研究,建立一套科学有效的质量评价方法。近年来,基于DNA测序和序列分析的DNA条形码技术以其快速、准确的特点广泛应用于中药材的物种基原和真伪鉴定方面,尤其是实时荧光定量PCR技术在快速、高效和高灵敏度方面具有更加独特的优势。由于不同品种的燕窝是由不同物种的金丝燕所产,而且其价格和质量差异巨大,为了更加全面地掌握不同品种和地理居群燕窝的生物基原,本项目收集了32种不同国家和不同品种的燕窝商品,分别针对Cytb、ND2、COI、12SrRNA基因序列,利用DNA条形码技术鉴别燕窝的基原,并探讨不同种类燕窝的品质分类关联,为燕窝的品质鉴定提供更为全面的分子生物学数据。方法:1. 收集了来自不同产地(不同国家和省份)和品种(包括屋燕、洞燕、白燕、血燕等)的31种官燕窝和1种毛燕窝,用口腔/咽拭子基因组DNA提取试剂盒提取燕窝中总DNA,使用引物ND5 (5'-TAGCTAGGATCTTTCGCCCT-3')和HI5709 (5'-GGCATATGCGAATARGAARTATCA-3')进行Cytb序列片段的扩增,PCR产物纯化后,用ABI3730测序仪进行双向测序。通过美国国立生物信息中心(NCBI)上的BLAST服务器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在GenBank基因库上进行在线搜索下载样品的相似序列,使用MEGA6.0中的ClustalW对样品序列进行比对,分析样品的保守位点、变异位点、简约信息位点等信息,Kimura 2-parameter模型计算遗传距离,采用邻接法构建NJ系统发育树。2.利用上述鉴定了生物基原的32个燕窝样品,根据数据库下载的金丝燕序列设计引物,分别针对ND2、COI、12SrRNA基因序列片段进行PCR扩增,利用相似性搜索法(BLAST)、最近距离法(nearest distance)等对燕窝的物种进行鉴定分析。利用软件MEGA6.0中的ClustalW对样品序列进行比对,分析变异位点;利用Kimura 2-parameter model计算遗传距离,构建Neighbor-joining系统发育树,利用Boostrap(1000次重复)检验各分支的支持率;最终建立燕窝商品基原物种的Cytb、ND2、COI、12S rRNA条形码序列。3. 根据序列分析找出在金丝燕属中保守却在其他物种中有差异的区域设计特异靶向金丝燕属物种的引物和TaqMan探针,蛋白酶K法提取燕窝线粒体DNA,采用实时荧光定量PCR技术对燕窝样品进行检测,以提取纯化后的正品燕窝基因组DNA为阳性标准品并稀释至不同倍数,以标准品模板拷贝数的对数作为横坐标,以实时荧光定量PCR的CT值为纵坐标,绘制标准曲线;以人、鼠、鸡、猪、鱼、海带等的线粒体DNA为阴性对照检测其特异性;对不同浓度的燕窝DNA模板进行检测考察其敏感性;对三个浓度的阳性标准品分别作5次重复检测以考察该方法的重复性和稳定性。4. 由于市场上多有将猪皮全部或部分掺入燕窝中的造假现象,为了有效鉴别出燕窝样品是否含有猪皮成分,借鉴食品方面检测掺假的方法,本实验分别选用猪的通用引物扩增其部分DNA序列,把猪皮分别按50%,30%,10%,5%,1%的比例掺入正品燕窝中,提取总DNA,进行PCR,电泳检测PCR产物并测序鉴定物种,以建立一种快速检测燕窝中猪源成分的PCR方法。结果:1. 将所得样品序列拼接校正后经MEGA软件对齐删减,最终选取所有样品长度均为290bp的一段峰形规则的Cytb序列。BLAST搜索结果显示各个样品相似性最高的前几十条序列均为雨燕科金丝燕属Aerodramus的物种,与其最相似序列的相似度均为100%。290bp的Cytb基因序列中,保守位点270个,保守位点占核苷酸总数的93.1%,变异位点20个,变异位点约占核苷酸总数的6.9%。K-2p遗传距离计算结果显示所有样品之间的遗传距离在0.000-0.062之间,从各样品序列的遗传距离和简约信息位点来分析,32个样品中将有三个基原物种的差异。NJ系统发育树结果显示,23个样品均与所有的爪哇金丝燕A erodram us fuciphagus聚为一支,支持率为84%,确定其生物来源为爪哇金丝燕;8个样品与所有的淡腰金丝燕Aerodramus fuciphagus germani聚为一支,支持率为74%,确定其生物来源为淡腰金丝燕;32号样品与所有的大金丝燕Aerodramus maximus聚为一支,支持率为96%,但由于Genbank上所查询的大金丝燕A. maximus和其亚种A. maximus lowi并未产生分支,因此认为该样品的生物来源为大金丝燕A. maximus或其亚种A. maximus lowi。2. 最终获得样品长度为124bp的一段ND2序列进行分析。BLAST搜索结果显示1-31号爪哇金丝燕和淡腰金丝燕所产的燕窝样品的最相似序列均为爪哇金丝燕A.fuciphagus,其中23个爪哇金丝燕燕窝样品的最高相似度为100%,另8个淡腰金丝燕燕窝样品的最高相似度为98%;32号大金丝燕所产的毛燕窝样品的最相似序列为大金丝燕A. maximus。NJ系统发育树结果显示,1-31号所有样品均与爪哇金丝燕A.fuciphagus聚为一支,支持率为62%;其中11、17、21、22、23、25、26、28号样品与其他样品又另分为一支,支持率为82%;32号样品与所有的大金丝燕A. maximus聚为一支,支持率为72%。将所有燕窝样品和Genbank下载的相关物种124bp的该段ND2序列进行比对,结果显示淡腰金丝燕A. fuciphagus germani与爪哇金丝燕A.fuciphagus存在2个简约信息位点,大金丝燕A. maximus的序列与爪哇金丝燕相比具有10个简约信息位点,而金丝燕属不同物种之间各自具有多个变异位点。3. 最终选取29个燕窝样品长度为179bp的一段COI序列进行分析, BLAST搜索及NJ系统发育树结果显示,关于燕窝样品的生物基原和Cytb及ND2序列的鉴定结果完全一致,所有淡腰金丝燕所产的燕窝样品单独聚为一支,支持率为79%。COI序列比对结果显示淡腰金丝燕A. fuciphagus germani与爪哇金丝燕A. fuciphagus存在2个简约信息位点,大金丝燕A. maximus的序列与爪哇金丝燕相比具有9个简约信息位点。4. 最终选取22个燕窝样品长度为560bp的一段12S rRNA序列进行分析,结果所有燕窝样品的生物基原和上述Cytb、ND2及COI序列的鉴定结果完全一致,所有淡腰金丝燕所产的燕窝样品单独聚为一支,支持率为84%。12S rRNA序列比对结果显示在该段序列上,爪哇金丝燕种群内有1个简约信息位点,淡腰金丝燕与其相比有5个简约信息位点,大金丝燕与其他两个物种相比有25个简约信息位点,而且有一碱基缺失。这一结果提示该段条形码对于鉴别金丝燕不同物种具有更多的参考信息。5. 实时荧光定量PCR结果显示,经琼脂糖凝胶电泳检测发现目的基因PCR产物大小约270bp,测序验证为爪哇金丝燕的Cytb序列;阳性标准品在3.7x107copies/μL-3.7×103copies/μL浓度拷贝数范围内和相对应的CT值之间线性关系良好,相关系数R2=0.964,线性关系方程式为:CT=-3.38(copy number)+16.304。特异性检测结果显示,不同来源和批次的燕窝样品均有扩增曲线,而人、鼠、鸡、鱼、海带等的线粒体DNA未见扩增曲线,表明所设计Cytb基因引物探针的特异性良好;加样量模板浓度在3.7×103copies/μL时实时荧光定量PCR仍然有扩增,说明具有良好的灵敏度,可检测痕量的燕窝样品。6. 含不同比例猪皮的燕窝样品进行PCR之后的电泳检测结果显示,猪皮阳性对照在130bp的地方有一明显条带,测序验证为猪的序列片段;掺不同比例猪皮的燕窝样品均在猪条带同一位置出现条带,不掺猪皮的正品燕窝在该位置无条带。结果证明该方法可以有效地检测燕窝中是否掺入猪源成分。结论:本文实验结果证明了市场上的官燕窝的生物基原为爪哇金丝燕A. fuciphagus或其亚种A. fuciphagus germani,毛燕窝的生物基原为大金丝藏A. maximus或其亚种A.maximus lowi;不同颜色、不同形状的燕窝商品,在生物基原上并无规律性;不同产地的燕窝与文献记载金丝燕的分布基本一致;洞燕大多是爪哇金丝燕的亚种淡腰金丝燕A. fuciphagus germani,而屋燕多是原种爪哇金丝燕A.fuciphagus。关于商品燕窝种类及产地在基因上的差异,尚须收集更多的燕窝样品来验证。本文所建立的Cytb、ND2、COI、12SrRNA序列条形码均可用于快速、准确鉴别燕窝的基原物种,并探索了Genbank中尚未报道的爪哇金丝燕亚种淡腰金丝燕A.fuciphagus germani的ND2、COI和12SrRNA序列片段。但由于Genbank有关金丝燕的数据信息和燕窝样品种类方面的限制,未能鉴别爪哇金丝燕的其它亚种,也未能将大金丝燕A. maximus和其亚种A. maximus lowi鉴别开来。本文所建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性和稳定性,可应用于燕窝及含痕量燕窝成分的真伪鉴别,准确性高、实用性强。燕窝中猪皮成分的PCR方法可针对掺有猪皮成分的燕窝伪品进行快速、准确的鉴定。


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