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化瘀消癥杀胚中药诱导输卵管妊娠滋养细胞凋亡的分子机制及临床研究

李晓荣  
【摘要】:异位妊娠(Ectopic pregnancy, EP)指受精卵在子宫腔以外的部位着床发育,其中超过95%患者为输卵管妊娠。输卵管妊娠是最常见的妇产科急腹症,占妇科急症的80%以上,首诊延误率可高达40%,是孕早期死亡的主要原因之一。近些年来,随着盆腔炎性疾病、人工流产、辅助生殖技术等高危因素的增加,输卵管妊娠的发病率呈逐年上升趋势,严重威胁育龄妇女的生命健康和生活质量。随着诊疗技术的发展使早期异位妊娠得以发现,使药物治疗成为可能,为更多年轻的患者提供了保全生育功能的机会。中医公认异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证,采用活血化瘀、消癥杀胚方药治疗早期输卵管妊娠疗效确切。化瘀消癥杀胚中药复方是根据中医理论而制定,由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草五味药组成,是宫外孕Ⅰ号方衍化而来,临床疗效确切,最大限度保全了患者的生育功能,提高了生活质量。一、临床部分目的:结合前期输卵管妊娠的中西医结合诊疗方案的研究,采用前瞻性、无盲法、不等随机对照研究,从临床有效性方面论述中药+甲氨蝶呤(MTX)与中药+米非司酮治疗输卵管妊娠的疗效及优势,为临床选择用药提供依据。研究方法:选择2012年1月至2013年12月输卵管妊娠病例,进行辨病分期,计算病情影响因子总积分后,确定可以进行“中西医结合”药物治疗的病例,随机将病例分为中药+MTX组与中药+米非司酮组。通过对比两组间的有效率、有效病例的腹痛消失时间、血β-HCG值下降时间、包块缩小情况,探讨中药+MTX与中药+米非司酮治疗输卵管妊娠各自的优势及可行性。研究结果:(一)纳入病例情况:根据诊断标准、纳入标准及排除标准,2012年1月至2013年12月共收集符合中西医结合药物治疗的输卵管妊娠病例103例,中药+MTX组54例,中药+米非司酮组49例。(二)病情影响因子情况103例病例中,25-29岁年龄段所占比例最高,约占38.8%,且无生产史者占43.00%;停经天数为43-56天所占比例最高,占64.28%;腹痛症状表现为隐痛者所占比例最多,占53%;B超下包块最大径3-5cm者较多;初始血β-HCG值在1000-2000IU/L之间者所占比例最高;病情影响因子总积分,中药+MTX组为8.648±1.456分,中药+米非司酮组为8.833±1.209分。使用t检验与秩和检验,中药+MTX组和中药十米非司酮组在年龄、孕产次、停经时间、腹痛情况、B超下包块最大径、B超下出血最大径、初始血β-HCG值和病情影响因子比较,差异无统计学意义(P0.05)。(三)疗效研究结果:中药+MTX组有效率为88.89%;中药+米非司酮组有效率为89.80%,两组疗效无明显差异(P0.05);中药+MTX组腹痛消失时间为4.23±2.52天,中药+米非司酮组为4.40±1.45天,两组比较差异无统计学意义(P0.05);观察组血β-HCG值下降至50%的时间中药+MTX组为5.704±1.550天,中药+米非司酮组为7.021±1.670天,两组比较中药+MTX组较中药+米非司酮组降HCG值效果更好(P0.05);下降至10%的时间中药+MTX组为20.34±6.22天,中药+米非司酮组为21.47±8.92天,两组总的降HCG水平方面效果相当(P0.05);中药+MTX组包块缩小率为85.19%,中药+米非司酮为73.47%,中药+MTX组在包块缩小程度方面优于中药+米非司酮组(P0.05)。二、实验部分目的:探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡的形态学、凋亡率及细胞凋亡通路影响,比较输卵管妊娠滋养细胞和宫内早期妊娠滋养细胞外观形态、生长曲线及化瘀消癥杀胚中药复方作用后凋亡率、凋亡形态及凋亡通路的异同。方法:(一)输卵管妊娠滋养细胞及宫内早孕滋养细胞的培养,免疫荧光细胞化学染色法进行细胞鉴定,绘制细胞生长曲线。(二)运用CCK一8法检测化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞生长抑制的影响,Hoechst染色、透射电镜观察化瘀消癥杀胚中药复方对两种细胞凋亡形态学及超微结构的影响,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测化瘀消癥杀胚中药复方干预后两种滋养细胞的凋亡率。(三) Western Blot及qRT-PCR法检测化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白及基因的影响。研究结果:(一)成功培养了输卵管妊娠滋养细胞及正常宫内早孕滋养细胞,免疫荧光细胞化学染色法鉴定结果显示细胞胞浆中有CK-18、cerb-2阳性信号,未见波形蛋白信号。两种细胞生长周期大致相同,均在第3-4天时达对数生长周期,5-6天后因细胞生长密度抑制作用进入平台期。(二)CCK-8法检测发现,经过终浓度为5、10、20.30、40mg/ml的化瘀消癥杀胚中药处理后的两种滋养细胞,不同作用时间对其的生长抑制作用各不同,其量效关系呈时间、浓度正相关性。化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞作用48h的半数最大抑制浓度:IC50=20.12mg/ml;对宫内妊娠滋养细胞作用48h的半数最大抑制浓度:IC50=23.98mg/ml。以此为依据,确定后续实验中药浓度,分别为中药高剂量组20mg/ml、中剂量组10mg/ml、低剂量组5mg/ml。(三)Hoechest染色法在倒置荧光显微镜下观察可见,不同浓度中药复方组中均出现不同程度核固缩、核碎裂及凋亡小体,以中药高剂量组20 mg/ml及中药+甲氨蝶呤组最明显。透射电镜下观察发现化瘀消癥杀胚中药复方作用48h后,滋养细胞表面微绒毛减少,体积变小、不同程度皱缩,常染色质变少,异染色质增多,集中在核仁边缘,或核仁萎缩、破裂,个别形成凋亡小体,内质网扩张呈泡状,与质膜融合,细胞器外渗、肿胀、细胞质内空泡状脂滴显著增多。两种滋养细胞的凋亡形态及超微结构无明显差异。(四)流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测各药物组作用于输卵管妊娠滋养细胞48h后,与阴性对照组相比,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加,其中高、中剂量组凋亡率明显增加(P0.01);与甲氨蝶呤组相比,中药高剂量组凋亡率增加(P0.05),而中药+甲氨蝶呤组与中药高剂量组凋亡率无明显差异。各药物组作用于宫内滋养细胞48h后,与阴性对照组相比,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加,其中高剂量组凋亡率明显增加(P0.01);中药高、中剂量组与甲氨蝶呤组及中药+甲氨蝶呤组相比,凋亡率无明显差异(P0.05)。各个药物组作用两种细胞48h后细胞凋亡率相比,并无明显差异(P0.05)。(五)输卵管妊娠滋养细胞中,与阴性对照组相比,中药组及中药+甲氨蝶呤组可使Bax、Fas1、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达增加,且中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组还可增加Fas1、Caspase-3的基因表达(P0.05),而Caspase-8蛋白增加不明显(P0.05),但基因表达明显增加;甲氨蝶呤组仅Caspase-9蛋白表达增加。在宫内妊娠滋养细胞中,与阴性对照组相比,中药组及中药+甲氨蝶呤组可使Bax、Fas1、 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达增加(P0.05),且中药高剂量组还可增加Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达(P0.05);甲氨蝶呤组Fas1、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达增加(P0.05),Fasl的基因表达亦增加(P0.05)。结论(一)中西医结合治疗输卵管妊娠疗效确切,中药+MTX在缩小包块方面疗效优于中药+米非司酮组,在HCG值下降、阴道流血、腹痛消失等方面疗效相当。(二)输卵管妊娠和宫内妊娠滋养细胞在形态和增殖能力上并无显著的差异,其生长特性相似。(三)化瘀消癥杀胚中药复方有抑制输卵管妊娠滋养细胞增殖、促进其凋亡的作用,这可能是其降低HCG、缩小异位妊娠包块治疗异位妊娠的机制之一。化瘀消癥杀胚中药对宫内妊娠滋养细胞的促凋亡作用和凋亡形态学方面与输卵管妊娠滋养细胞无明显差异。(四)化瘀消癥杀胚中药复方作用输卵管妊娠滋养细胞及宫内妊娠滋养细胞后,均可上调Fas/FasL.Bcl-2/Bax凋亡通路相关蛋白的表达,提示化瘀消癥杀胚中药复方可能通过诱导Caspase介导的死亡受体及线粒体凋亡通路而促进滋养细胞凋亡。


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