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帕病2号方对多巴胺神经元氧化应激损伤的保护性研究

易秋香  
【摘要】:目的:一探讨帕病2号方对帕金森病大鼠的神经保护作用。二探讨帕病2号方含药血清通过降低ROS保护iPSC诱导的人多巴胺能神经元细胞的作用机制。三研究帕病2号方对PD小鼠中移植的iPSC诱导的人DA细胞的保护作用。方法:一、PD大鼠模型的制备、灌胃及相关指标的检测1.通过对Wistar大鼠进行纹状体注射6-OHDA,构建PD大鼠模型;定期进行阿扑吗啡(APO)颈背部皮下注射,观察有无旋转行为,若旋转次数大于210转/30min,则造模成功,再给予不同剂量的帕病2号方药液,观察4周内帕病2号方对PD大鼠的旋转次数的改变。2.取部分新鲜中脑组织进行10%甲醛固定、脱水、包埋处理,组织切片后,采用免疫组织化学染色法检测PD大鼠TH的表达量。3.取部分新鲜中脑组织,提取总蛋白,采用Western Blots法检测PD大鼠Nrf2蛋白的表达。4.取部分新鲜中脑组织,提取RNA,采用qPCR法检测PD大鼠抗氧化相关基因NQO1、HO-1、MRP2、GPX2 的表达。二、细胞损伤模型的建立,含药血清的干预及相关指标检测。1.预先用10%血清处理DA细胞12h,然后模型组和血清处理组分别加100μ MH2O2损伤12h,同时空白组加等量的细胞培养液,最后收集细胞,采用活性氧检测试剂盒进行流式检测,观察细胞内的ROS水平。2.收集细胞,采用免疫荧光染色,检测细胞内的TH和TUJ-1的阳性率,以及TH/TUJ-1双阳性率。3.收集细胞,提取RNA,进行逆转录,采用qPCR法检测DA细胞内的抗氧化相关基因 Nrf2、NQO1、H0-1、MRP2、GPX2 的表达。4.收集细胞,提取RNA,进行逆转录,采用qPCR法检测DA细胞的DA能神经元相关基因 TH、TUJ-1、Nurr1、PITX3、Foxa2 的表达。三、PD小鼠模型的制备,DA细胞的移植,灌胃及相关指标检测。1.通过对NOD scid小鼠腹腔注射MPTP(40mg/kg),构建PD小鼠模型,纹状体部移植1×105个iPSC诱导的DA细胞,然后灌胃帕病2号方药液4周,观察4周内PD小鼠的行为学变化。2.动物取材后,取新鲜的中脑组织,提取RNA,进行逆转录,采用qPCR法检测PD小鼠内TH的表达。结果:一、帕病2号方对6-OHDA诱导的PD大鼠模型的保护作用1.帕病2号方对PD大鼠的行为学影响:假手术组经APO诱导后未出现旋转行为,6-OHDA组则出现旋转行为,且旋转次数210转/30min;在第3周,高、中剂量组旋转速度开始降低,且旋转次数210转/30min,与模型组比较,差异有统计学意义;在第4周,高、中剂量组的旋转速度降到最低,与模型组比较,有显著性差异。2.帕病2号方对PD大鼠TH含量的影响:高剂量组的TH含量高于模型组,具有显著性差异。3.帕病2号方对PD大鼠Nrf2蛋白表达的影响:与模型组比较,高剂量组的Nrf2核蛋白高表达,具有显著性差异。4.帕病2号方对PD大鼠抗氧化相关基因NQ01、HO-1、MRP2、GPX2的影响:与模型组比较,高剂量组的抗氧化相关基因NQO1、GPX2表达升高,差异有统计学意义;与模型组比较,高剂量组的抗氧化相关基因HO-1、MRP2基因表达增加,具有显著性差异。二、帕病2号方含药血清具有通过降低ROS保护iPSC诱导的人多巴胺能神经元细胞的作用1.ROS水平:与空白组比较,模型组的ROS水平高,具有显著性差异;与模型组比较,含药血清组的ROS水平低,具有显著性差异。2.免疫荧光:与模型组比较,含药血清组的TH/TUJ-1阳性细胞数增加,差异有显著性意义。3.抗氧化相关基因的表达:与模型组比较,含药血清组的抗氧化相关基因NQO1、HO-1表达升高,具有显著性差异,;与模型组比较,含药血清组的抗氧化相关基因MRP2、GPX2表达升高,有统计学意义。4.DA神经元相关基因的表达:与模型组比较,含药血清组的DA神经元相关基因TH、TUJ-1、Nurr1、PITX3、Foxa2的表达升高,具有显著性差异。三、帕病2号方具有对PD小鼠中移植的iPSC诱导的人DA细胞的保护作用1.行为学:给药组的潜伏期长于不给药组,差异有统计学意义;掉落次数少于不给药组,具有显著性差异。2.TH基因表达:与不给药组比较,给药组的TH基因表达上升,具有显著性差异。结论:1.帕病2号方能改善PD大鼠的行为学表现,调节中脑的TH含量,增强Nrf2等抗氧化基因的表达及Nrf2蛋白的表达,抑制神经毒性物质6-OHDA对大脑的氧化损伤反应,从而保护多巴胺神经元。2.氧化损伤后的DA细胞,经帕病2号含药血清干预后,增加NQO1等抗氧化基因的表达,并提高TH等多巴胺神经元基因的表达,从而降低DA细胞的氧化损伤反应,起到保护多巴胺神经元的作用。3.帕病2号含能延长移植的DA神经元细胞的存活量。


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