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miRNA与AQP2在真武汤治疗阿霉素肾病综合征中的作用机理研究

梁春玲  
【摘要】:目的:肾病综合征(Nephrotic syndrome, NS)为儿童多发难治性疾病,发病率高达2-10/100000,为仅次于急性肾小球肾炎的第二大肾脏疾病,严重影响人类健康。NS病理分型复杂多样,临床诊断及治疗难度大,一线用药主要为糖皮质激素类免疫抑制剂,但激素治疗存在复发、激素抵抗及长期用药副作用等问题,因此,探讨NS发病机制,寻找安全有效的NS治疗药物具有重要意义。真武汤为《伤寒论》中温阳利水的代表方剂,临床广泛应用于慢性肾病的治疗,在NS治疗中取得一定疗效。AQP2在肾脏水钠代谢平衡和肾小管功能中具有重要作用,为水液代谢紊乱相关疾病治疗的关键病理基础,为NS治疗的关键作用靶点;研究发现miRANs在维持肾脏稳态中具有核心调节作用,同时也是AQP2潜在的重要调节机制。本课题以AQP2及miRNA为切入点,探讨AQP2及miRNAs在NS发病中的参与机制,并利用生物信息学预测手段,体外功能获得及缺失实验筛选NS发病中调控AQP2表达的miRNA,以此探讨NS发病机制及真武汤治疗NS的作用机理。方法:1.真武汤对阿霉素NS大鼠的治疗作用研究采用一次性尾静脉注射阿霉素(6.0mg/kg)制备阿霉素NS大鼠模型,造模一周后,给予真武汤高(16.8g·kg-1·d-1)、低(8.4 g·kg-1·d-1)治疗,连续给药四周。通过测定24h尿蛋白、血清蛋白、血脂、血肌酐、血清尿素氮及肾脏病理(HE染色病理检查,电镜检查)评价真武汤对NS的治疗作用;并测定血浆SOD, MDA水平以及肾组织炎症因子水平,探讨真武汤对NS氧化以免疫炎症损伤的调节作用。2.真武汤对阿霉素NS大鼠水肿及肾脏AQP2表达的影响制备阿霉素NS大鼠模型,造模一周后给予真武汤高(16.8g·kg-1·d-1)、低(8.4g·kg-1·d-1)治疗,连续给药四周。通过检测各组大鼠腹水重量、肾脏指数以及血液及尿液Na+、K+、Cl-含量,考察真武汤对NS大鼠水肿及电解质的的调节作用;并检测血清(AVP)及醛固酮(ALD)水平,测定各组大鼠肾组织AQP2表达及分布情况,探讨真武汤治疗NS的可能作用机制。3.肾病综合征大鼠肾脏miRNA差异表达谱研究分别取正常及阿霉素NS模型大鼠肾组织,提取总RNA,纯化后进行miRNA标记、杂交。应用GenePix Pro 6.0读取芯片结果,对结果进行中值标准化,筛选差异表达的miRNA;利用生物信息学预测工具,对差异表达miRNA进行靶基因预测,GO功能富集及Pathway分析,构建miRNA-mRNA调节网络,挖掘可能性高的靶基因及调节通路,探讨miRNA在NS发病中的调节作用及调节机制。4.筛选真武汤治疗NS中可调控AQP2表达的miRNA利用生物信息学预测手段,结合miRNA芯片结果及qRT-PCR验证,以及体外过表达或抑制miRNA活性,筛选NS中可能调控AQP2表达的miRNA;并通过荧光素报告酶实验验证目标miRNA与AQP2间的调控关系,MTT及流式检测miRNA对集合管细胞增殖及凋亡的影响,结合真武汤含药血清干预实验,评价真武汤对AQP2及miRNA的调节作用。结果:1.真武汤对阿霉素NS大鼠的治疗作用研究(1)阿霉素注射可诱导典型的NS模型,造模两周后模型组蛋白尿升高较空白对照组具有统计学意义,真武汤治疗两周后可降低阿霉素NS大鼠蛋白尿,改善高血脂及低蛋白血症,恢复NS大鼠肾功能;肾脏病理提示各组肾小球结构基本正常,模型组大鼠肾小管及肾间质存在明显肿胀,存在大量的蛋白管型及透明管型,真武汤可改善肾小管水肿,改的肾小管管型。(2)真武汤具有一定的抗氧化作用作用,可减少阿霉素NS大鼠肾脏氧化损伤,增强肾脏抗氧化能力,同时对肾脏免疫炎症具有一定的调节作用,可上调肾组织IL-4表达,下调IL-8的表达。2.真武汤对阿霉素NS大鼠的电解质及肾脏水肿的作用研究(1)阿霉素诱导的NS大鼠有明显水肿表现,表现为腹水增多,肾脏肿大,肾脏指数增加,且尿量较正常大鼠明显减少;真武汤治疗可明显改善肾脏水肿,具有一定利尿作用,可促进肾脏钠排泄,而对尿液钾离子及氯离子排泄量没有明显变;(2)阿霉素NS大鼠血清ALD及AVP较正常对照组明显升高,真武汤治疗可降低ALD含量,对血清AVP水平上调无明显作用:阿霉素NS大鼠肾脏AQP2表达较正常对照组明显降低,残存的AQP2主要分布在集合管细胞顶端质膜,提示AQP2表达抑制,而胞内转运机制并未受到影响,真武汤治疗可明显提高肾脏AQP2表达,从而提高AQP2在集合管细胞顶端质膜的分布。3.肾病综合征大鼠肾脏miRNA差异表达谱研究与正常对照组相比,阿霉素NS大鼠肾脏miRNA表达谱分析共发现123个差异表达miRNAs (fold chang2.0),其中有48个miRNA明显上调,75个明显下调,提示miRAN在NS发病中有具有重要作用。与李春庆等在PAN肾病大鼠肾脏miRNA芯片结果比较及验证,发现有11个miRNA重合,提示这些可能是NS发病中具有代表性miRNA。对这些差异miRNA进行生物信息学分析发现,miRNAs对肾脏具有多重调节作用,对NS水钠代谢紊乱的多条通路均有调节作用,对NS免疫炎症反应、间质纤维化及肾脏自噬可能具有重要调节作用。4.AQP2及miRNA在肾病综合征发病中的作用及真武汤干预研究(1)结合生物信息学预测手段和芯片结果,miR-92b及miR-340-3p可能是NS发病中调节AQP2表达的miRNA,真武汤可调节肾脏miR-92b的表达,而对miR-340-3p作用不明显;miR-92b过表达可明显抑制集合管AQP2蛋白表达,而抑制miR-92b的作用可上调AQP2蛋白表达,过表达或抑制miR-340-3p对AQP2蛋白表达无明显作用,提示miR-92b可调节AQP2表达。(2)荧光素报告酶实验结果发现,AQP2野生型质粒与miR-92b模拟物可显著降低AQP2野生型的报告荧光,而对AQP2预测靶位点进行突变后,与miR-92b模拟物共孵育后,突变型载体中的报告荧光无明显下调作用,提示miR-92b可直接调节AQP2表达;过表达miR-92b可抑制集合管细胞增殖,促进细胞早期凋亡,真武汤可抑制miR-92b表达,减少miR-92b上调诱导的结合管细胞损伤,提示miR-92b对集合管细胞结构和功能可能具有重要调节作用,真武汤可通过调节集合管miR-92b及AQP2表达,维持集合管细胞功能稳定。结论:1.真武汤对阿霉素NS大鼠具有一定的保护作用,对蛋白尿、高血脂、低蛋白血症及肾功能具有一定改善作用,其作用与其调节肾脏炎症反应,增强肾脏抗氧化能力可能具有一定关系:2.真武汤对阿霉素NS大鼠腹水及肾肥大具有明显的改善作用,可改善肾小管水肿及管型蛋白,这可能与真武汤利尿、促进肾脏尿钠排泄有关、降低血清醛固酮水平有关,提示真武汤对NS水肿具有较好治疗作用,对肾小管具有一定保护作用;3.AQP2在阿霉素NS大鼠中表达下调,但其胞内转运机制并未受到抑制,AQP2在集合管细胞顶端质膜分布无明显变化,而阿霉素NS大鼠血清AVP表达较正常组升高,提示AVP可能参与了AQP2短期调节,而有其他调节机制参与了AQP2的表达抑制调节;4.NS大鼠肾脏miRNAs与正常对照组大鼠存在较大差异,miRNAs对NS发病的多个关键环节均有重要调节作用;5.miR-92b在阿霉素NS大鼠肾脏表达升高,可直接调控AQP2表达,可能参与了NS中AQP2抑制的调节,过表达miR-92b可诱导肾小管上皮细胞凋亡,提示miR-92b可能通过其他途径参与NS疾病的发生发展。综上,真武汤治疗阿霉素NS的机制可能包括:①减少肾脏免疫炎症损伤,减轻肾脏氧化损伤,提高肾脏抗氧化能力;②减轻肾脏水肿,调节肾脏水钠代谢;③调节肾脏AQP2表达,维持正常肾小管结构和肾脏水液代谢功能;④通过调节miR-92b参与肾脏功能的调节。


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