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中药臭灵丹抗流感病毒活性成分分离及其药效机制研究

王玉涛  
【摘要】:目的:从传统中药臭灵丹中分离纯化具有确切抗流感病毒的活性成分(群),并分析化学成分组成,以明确其药效物质基础。研究活性成分对不同亚型流感病毒,包括人及禽流感病毒活性,明确抗病毒谱及活性强度,并进一步分析不同活性成分对流感病毒感染诱导的相关宿主信号通路和细胞因子、趋化因子影响,从而阐明臭灵丹的抗流感病毒药理机制,为其临床应用提供科学依据。方法:通过甲醇、乙醇等不同极性溶剂对臭灵丹药材进行分离提取纯化,获得提取物及不同活性组分,以噻唑蓝染色法(MTT法)检测各个提取物或组分的体外细胞毒性,以细胞病变抑制法筛选其体外抗流感病毒药效及对不同亚型流感病毒的抗病毒谱,以UHPLC-QTOF MS对活性组分进行成分分析及指认。利用蛋白免疫印迹技术检测活性组分对流感病毒感染相关的宿主细胞信号通路影响,包括NF-κB, P38/MAPK, ERK/MAPK等,以实时荧光定量PCR技术检测活性组分对流感病毒诱导的细胞因子及趋化因子信使RNA (mRNA)表达水平影响,利用Bio-Plex悬浮芯片系统验证细胞因子及趋化因子在蛋白水平表达变化,并通过小鼠流感病毒性肺炎模型研究活性组分体内抗病毒药效及其机制。成果:(一)臭灵丹乙醇提取物体内、外抗流感病毒药效结果臭灵丹乙醇提取物在体外预防给药模式和治疗给药模式下对甲1型流感病毒PR8株均有抑制作用,IC50分别为0.31mg/mL和0.73mg/mL,SI分别为9.90和4.21;在小鼠流感肺炎模型证实,臭灵丹药物高、中、低剂量组(分别为1600 mg/kg.d、800 mg/kg.d和400mg/kg.d)均可有效降低流感感染小鼠肺指数,并对病毒感染引起的病毒间质性肺炎具有一定的抑制作用。(二)臭灵丹活性组分C8的抗流感病毒活性、药效机制及其成分组成分析结果通过石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水从臭灵丹醇提物中进一步分离得到多个组分,并对其中C5,C6,C7,C8,C9,C10进行体外药效筛选,结果显示组分C5和C8具有抗流感病毒活性,对PR8株IC5o分别为68,21μg/ mL, 25μg/mL,而C6, C7, C9, C10则无抗病毒活性。基于C8抗病毒活性较强,进一步筛选其抗流感病毒谱,结果显示C8对2009新甲型H1N1流感病毒,季节性H1N1流感病毒,乙型流感病毒FluB,以及低致病性禽流感病毒H6N2, H7N3, H9N2均有抑制作用,IC50分别为50μg/mL,19.9μg/mL, 50μg/mL, 84.8μg/mL, 80.2μg/mL, 91.4μg/mL,即对人及禽流感病毒均有抑制活性,具有广谱性。药效机制研究显示,利用HEK293细胞(稳转pNF-κB-Luc质粒)检测活性组分C8对宿主细胞信号通路NF-κB作用,结果表明其在10μg/mL和20μg/ mL浓度下,对TNF-α (20ng/mL)和流感病毒(PR8株,0.1MOI)激活的NF-κB通路均有显著抑制作用,荧光比值较病毒组显著降低;蛋白免疫印迹实验结果证实其在10μg/mL, 20μg/mL, 40μg/mL浓度下均可有效抑制NF-κB相关蛋白p65的磷酸化,在80μg/mL浓度下则完全抑制p65蛋白的磷酸化,而对ERK/MAPK通路蛋白则无抑制作用。对活性组分C8的UHPLC-MS分析的色谱峰进行指认,共鉴定得到63个化学成分,C8的活性成分包括:桉烷型倍半萜及糖苷和黄酮类化合物,其中主要活性成分:峰23分子量为222,确定分子式为C15H26O,推测鉴定为Laggerol; Isointermedeol; ent-7 (11)-seli nen-4-ol ; 7-Epi-β-eudesmol ; 7-epi-γ-eudesmol,结构以桉烷型倍半萜醇为主;峰28+29,其中28分子量为234,确定分子式为C15H22O2,鉴定结构为costic acid/isocostic acid; Pterodontic acid,同属于桉烷型倍半萜酸;峰29分子量为452,确定分子式为C24H36O8,与峰26对应化合物结构4-0-acetyl-cuauthemone-3-0-[2-methyl-2-hydroxy-3-acetoxybutyrate] pterodonoic acid互为异构体,为一种桉烷型倍半萜酸。(三)臭灵丹活性组分Fr14的成分分析及药效机制研究结果以Dictionary of Natural Products中(简称为DNP,其为天然产物最全最详细的数据库,目前收载了226,000个天然化合物,并根据文献定期更新)及有关文献报道的六棱菊属化学成分为依据,建立六棱菊属化学成分的数据库,对臭灵丹草药材UHPLC-QTOF MS分析的色谱峰进行指认,共鉴定得到138化学成分,采用UHPLC-QTOFMS对洗脱的流份进行分析,合并成分相近的流份,得到23个洗脱部位,对不同洗脱部位进行UHPLC-QTOF MS的分析,同时分析臭灵丹MCI不同部位固体物重量,结果显示环醇主要富集在Fr04-Fr07部位,其中主要成分为峰18,19和20,鉴定为二咖啡酰奎宁酸类化合物。倍半萜酸主要富集在Fr12-Fr14部位,其中主要成分为峰99+100:分子离子峰[M+H]+分别为235.1693和527.3339,对应分子式分别为C15H22O2和C32H46O6,前者鉴定结构为costic acid、2α-Acetoxycostic acid, isocostic acid, Pterodontic acid的异构体,后者结构未知,需要通过核磁进一步确认。黄酮主要富集在Fr16-Fr17部位,其中主要成分为峰102:分子离子峰[M+H]+为375.1074,对应分子式为C19H18O8,鉴定该化合物结构为chrysosplenetin B, casticin的同分异构体。其余部位中如峰121:分子离子峰[M+H]+为389.1231,对应分子式为C20H20O8,鉴定结构为artemitin的同分异构体。另外,图4~图6中*化合物、#化合物和$化合物的分子式分别为C24H23NO4、C23H21NO3、C21H22O8,其中*化合物和#化合物包含杂原子N,均在原药材中未检出,固体物重量分析表明倍半萜酸部位(Fr12-Fr14 )和黄酮部位(Fr16-Fr17)为臭灵丹的主要成分。通过对分离得到23个组分药效筛选,结果显示只有Fr14与Fr16具有抗流感病毒作用(PR8株),IC50分别为79.4μg/mL, 25μg/mL,进一步对Fr14与Fr16进行抗流感病毒谱筛选,结果显示Frl4对2009新甲型H1N1流感病毒,季节性H1N1流感病毒,季节性H3N2流感病毒均有抑制作用,IC50分别为43.5μg/mL, 128.2μg/mL, 75μg/mL;Fr16对2009新甲型H1N1流感病毒,季节性H1N1流感病毒具有抑制作用,IC50分别为4.2μg/mL, 37.1μg/mL具有广谱抗流感病毒活性。由于Fr16药物细胞毒性浓度较低,后续机制研究只针对Frl4,通过时间点实验结果证实Frl4主要作用于流感病毒感染早期复制阶段,在感染后0-6h给药,抑制效果最明显。蛋白免疫印迹实验证实Frl4在150μg/mL, 100μg/mL和50μg/mL浓度条件下,可有效抑制A549细胞信号通路相关蛋白P65/NF-κB, P38/MAPK的磷酸化,而对ERK通路无抑制作用,同时可抑制COX-2表达,尤其是在150μg/mL条件下,抑制效果最明显。炎症因子mRNA水平检测结果显示在感染后4h,组分Fr14在50μg/mL和150μg/mL浓度下对TNF-α, IP-10, IFN-α, MIG, IL-8, MIP-1α具有明显抑制作用;在感染后8h,50μ/mL浓度下对IL-6, MCP-1具有明显抑制作用,150μ/mL浓度下对IP-10, MIG, IL-6, MCP-1具有明显抑制作用;在感染后16h, 50μg/mL浓度下对IP-10具有明显抑制作用,150μg/mL浓度下对IP-10,MIG, IL-6具有明显抑制作用。蛋白水平检测结果显示组分Fr 14在150μ/mL,100μg/mL和50μg/mL浓度条件下均可有效抑制流感病毒诱导的炎症因子TNF-α, IL-8, IL-6, MCP-1, IP-10, RANTES的过度表达。结论:臭灵丹醇提物及分离组分均有抗病毒活性,证实药物臭灵丹具有确切的抗流感病毒作用。通过不同分离技术获得组分C8和Fr14,经成分分析结果显示其药效物质基础为倍半萜类化合物。药效结果表明其抗病毒谱广,对不同亚型流感包括人及禽流感病毒均有效,作用机制为通过抑制流感病毒诱导的相关宿主细胞信号通路及细胞因子、趋化因子表达发挥抗病毒作用,具有较好的抗流感病毒药物开发前景。


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