补肾解毒方治疗猴艾滋病模型疗效及对胃肠道粘膜天然免疫影响的研究

【摘要】：目的:应用补肾解毒方治疗中国恒河猴艾滋病模型,观察其疗效;研究补肾解毒方治疗中国恒河猴艾滋病模型疗效的胃肠道粘膜天然免疫机制;探索艾滋病治疗的免疫活化与免疫耐受之间的平衡。方法:(1)应用SIVmac239注射建立16只中国恒河猴艾滋病动物模型,随着感染时间的变化,观察健康组、模型急性期、模型慢性期的临床症状积分、血液常规、血液和淋巴结中T淋巴细胞亚群、血浆中天然免疫因子甘露糖结合凝集素(MBL)和α-防御素的变化、血浆SIV病毒载量以及胃肠道粘膜、淋巴结病理状态,确定中国恒河猴艾滋病动物模型造模成功。(2)将16只中国恒河猴艾滋病动物模型随机分为治疗组和模型对照组;治疗组8只应用课题组长期研究中药治疗艾滋病组方优化研制的补肾解毒方治疗,每日1次下胃管灌胃,剂量4.5g.kg-1.d-1,连续90d。模型对照组灌胃等量生理盐水。分别在治疗前、治疗第30天、第50天、第80天和治疗第100天时检测治疗组和模型组的血液常规、血液T淋巴细胞亚群和血浆SIV病毒载量;分别在治疗前、治疗第50天和治疗第100天时检测治疗组和模型组淋巴结中CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞,并与健康组比较,客观评价其疗效。(3)在治疗前处死4只模型对照猴子,治疗第50天处死4只治疗组猴子,治疗第100天时处死治疗组和对照组猴子各4只,取静脉血、腹股沟淋巴结、胃和回肠组织标本。检测处死猴子的胃肠道组织和淋巴结病理;应用ELISA检测血浆和胃肠道粘膜中天然免疫因子MBL、分泌型IgA(SIgA)、α-防御素,白介素12(IL2)、白介素15(IL15)的浓度;应用Western Blotting检测天然免疫信号通路蛋白受体CCR5、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、NF-KB、TLR4、TLR7的表达情况;以及应用免疫组化检测CD56、CD103、CD11c、CD80、CD86分子的变化情况,探索艾滋病的天然免疫调节机制和免疫活化与免疫耐受的平衡机制。结果:(1)中国恒河猴艾滋病动物模型造模后血常规波动均在正常范围值里,AIDS模型组、AIDS治疗组与健康组病毒载量对数值比较差异有统计学意义,AIDS模型组和治疗组均有较高的病毒表达,健康组未检测到病毒;AIDS治疗组、AIDS模型组与健康组之间CD4%、CD8计数、CD8%、CD4/CD8差异有统计学意义;AIDS治疗组和AIDS模型组之间各指标无统计学差异;AIDS治疗组的CD4%、CD4/CD8低于健康组,CD8%高于健康组,差异有统计学意义;AIDS模型组CD4%、CD4/CD8低于健康组,CD8%、CD8计数高于健康组,差异有统计学意义;AIDS治疗组、AIDS模型组与SIV急性感染组之间CD3计数、CD4计数、CD8%、CD4/CD8差异有统计学学意义;艾滋病模型组和治疗组淋巴结病理、回肠和胃组织病理符合人类艾滋病病理表现;AIDS治疗组和模型组淋巴结的CD4计数、CD8计数均低于健康组,差异有统计学学意义。(2)中国恒河猴艾滋病动物模型血浆天然免疫因子的变化情况:恒河猴SIV病毒感染急性期MBL变化有统计学意义,CD4计数的变化无统计学差异。随着感染时间的延长血浆MBL浓度下降趋势;恒河猴SIV急性感染期随着感染时间的延长,从第1周开始,血浆α—防御素浓度呈上升的趋势。(3)补肾解毒方治疗中国恒河猴AIDS模型的疗效:①补肾解毒方治疗中国恒河猴AIDS可以显著提高其CD4%、CD4计数、CD8%、CD8计数,并能维持CD4/CD8水平。②AIDS治疗组和健康恒河猴的比较发现:治疗前治疗组CD4%、CD4/CD8低于健康组,通过补肾解毒方治疗组提高了 CD4%、CD4/CD8计数水平与健康组比较差异无统计学意义。③通过治疗组和模型组比较发现:治疗组和模型组CD4%随时间变化的趋势不同(P=0.003),治疗组CD4%高于模型组(P=0.001);治疗组和模型组CD4计数随时间变化的趋势不同(P=0.003),治疗组CD4计数高于模型组(P=0.006);治疗组CD8%高于模型组(P=0.000);治疗组和模型组CD8计数随时间变化的趋势不同(P=0.004),治疗组CD8计数高于模型组(P=0.001);治疗组CD4/CD8计数高于模型组(P=0.003)。④通过治疗组和模型组比较发现补肾解毒方有一定的清除血浆SIV病毒的功效,治疗组病毒载量低于模型组(P=0.001),而且治疗组治疗30天后有编号147和编号357两只猴重复检测未检测出血浆SIV病毒,其他治疗组病毒降幅达到1.851og,治疗50天后平均降幅达到0.951og。⑤通过治疗组和模型组病理学比较发现补肾解毒方可改善胃粘膜固有层炎细胞浸润,减少淋巴滤泡和粘膜下胶原纤维沉积。防止肠粘膜炎细胞浸润和Peyer' s斑形成。改善淋巴结的淋巴滤泡溶解和衰竭,促进淋巴组织增.生和血管循环改善。⑥通过治疗组和模型组淋巴结免疫组化比较发现:治疗组和模型组淋巴结CD4随时间变化的趋势不同(P=0.001),治疗组CD4高于模型组(P=0.000);治疗组和模型组淋巴结CD8随时间变化的趋势不同(P=0.002),治疗组CD8高于模型组(P=0.000);补肾解毒方可提高淋巴结产生CD4、CD8淋巴细胞。⑦经过补肾解毒方治疗治疗组临床症状改善优于模型对照组,治疗组未出现严重临床症状和药物毒副反应,模型组有一只猴子出现艾滋病衰竭表现而死亡。(4)补肾解毒方治疗中国恒河猴AIDS模型疗效的天然免疫调节机制:①恒河猴AIDS治疗组和模型组血浆中MBL随时间变化的趋势不同(P=0.004);治疗组高于模型组(P=0.000);补肾解毒方治疗后胃粘膜MBL水平低于模型组,比较差异具有显著性。② 恒河猴AIDS治疗组和模型组血浆中α-防御素随时间变化的趋势不同(P=0.000);治疗组高于模型组(P=0.000);补肾解毒方治疗后胃肠道粘膜α-防御素水平明显提高,与模型组比较差异具有显著性。③恒河猴AIDS治疗组和模型组血浆中IL2随时间变化的趋势不同(P=0.000);治疗组高于模型组(P=0.000);补肾解毒方治疗后肠粘膜IL2水平提高,与模型组比较差异有统计学意义。④恒河猴AIDS治疗组和模型组血浆中IL15随时间变化的趋势不同(P=0.000);治疗组高于模型组(P=0.000);补肾解毒方治疗后肠粘膜IL15水平提高,与模型组比较差异具有显著性。⑤恒河猴AIDS治疗组和模型组血浆中SIgA随时间变化的趋势不同(P=0.000);治疗组高于模型组(P=0.000);补肾解毒方治疗后肠粘膜SIgA水平提高,与模型组比较差异具有显著性(P=0.000);补肾解毒方治疗后胃肠道粘膜SIgA水平提高,与模型组比较差异具有统计学意义。⑥补肾解毒方治疗后可以下调恒河猴AIDS模型中胃粘膜CCR5、肠粘膜CCR5胃粘膜NFκB(p65)、肠粘膜NFκB(p65)、胃粘膜TLR7、肠粘膜TLR7、胃粘膜TLR4肠粘膜TLR4蛋白的表达,与模型组比较差异具有显著性;其中治疗50天组各指标表达均低于其他三组差异具有统计学意义。⑦补肾解毒方治疗后可以上调中国恒河猴AIDS模型中胃肠道粘膜中MAVS蛋白的表达,与模型组比较差异具有显著性。⑧补肾解毒方治疗后可以上调恒河猴AIDS模型中胃粘膜CD56、肠粘膜CD56、胃粘膜CD11c、肠粘膜CD11c、胃粘膜CD103、肠粘膜CD103的表达,与模型组比较差异具有显著性。⑨补肾解毒方治疗后可以下调恒河猴AIDS模型中胃粘膜CD80、肠粘膜CD80、胃粘膜CD86、肠粘膜CD86的表达,与模型组比较差异具有显著性。结论:(1)中国恒河猴感染SIV后,逐渐进展为AIDS期,从临床症状表现、血液T淋巴细胞亚群、淋巴结和肠胃组织病理均区别于急性感染期模型,而与人类AIDS病情相似。(2)补肾解毒方治疗恒河猴AIDS模型,可以改善临床症状,能提高外周血和淋巴结CD4和CD8T淋巴细胞亚群的数量,尤其对CD8T淋巴细胞数量提高更明显。(3)补肾解毒方治疗中国恒河猴AIDS模型通过改善肠胃粘膜组织病理,促进天然免疫NK细胞、树突状细胞的产生和功能增强,DC与T细胞结合后会大量分泌多种天然免疫因子(MBL、α-防御素、IL2、IL15、SIgA),从而激活T细胞增殖,诱导CTL生成,从而抑制SIV病毒的复制;补肾解毒方治疗中国恒河猴AIDS模型启动MAVS信号通路,下调NFK B和CCR5的表达,减少了病毒结合和破坏CD4T淋巴细胞,从而提高了血液和淋巴结中CD4T淋巴细胞水平;提高CD56、CD103、CD11c的表达,降低CD80、CD86的表达,形成免疫耐受,防止免疫过度活化造成的损伤。因此,补肾解毒方治疗中国恒河猴AIDS模型形成了免疫活化与免疫耐受之间的平衡,延缓了疾病的进展。