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黄芪多糖通过多胺和钙离子调节IEC-6细胞迁移的研究

曾丹  
【摘要】:研究背景胃肠黏膜损伤是胃肠道疾病的发病基础之一。多种胃肠疾病存在胃肠黏膜损伤的病理改变。以益气健脾法治疗慢性胃炎、消化性溃疡、炎症性肠病等疾病证属脾虚者有确切疗效,益气健脾方药对胃肠道相关病症的治疗作用可能与其保护胃肠黏膜完整及促进黏膜损伤后修复的作用有密切关系。胃肠黏膜是人体更新最快的组织,具有很强的自我修复能力。胃肠黏膜损伤后修复包括快速整复阶段和后续的修复阶段。快速整复阶段主要在损伤后数分钟至数小时发生,由损伤附近的剩余的有活性的细胞向损伤部位迁移并重新覆盖损伤部位,此过程不依赖细胞增殖。在小肠上皮细胞(IEC-6)的研究表明,多胺对细胞迁移是必需的。多胺可通过增加细胞电压门控钾通道蛋白Kv1.1表达、促进细胞膜电位超极化而调控Ca~(2+)内流驱动力;储存操纵性钙通道(SOC)是细胞Ca~(2+)内流主要通道之一,TRPC1作为SOC通道蛋白,对调控Ca~(2+)内流驱动力和[Ca~(2+)]cyt起重要作用。STIM1作为胞内钙库Ca~(2+)感应器是激活SOC的关键指标;胞内钙库Ca~(2+)耗竭时STIM1从内质网移位到浆膜与TRPC1形成STIM1/TRPC1复合体,进而增强TRPC1介导的Ca~(2+)内流而促进细胞迁移。STIM2是SOC的负调控蛋白,多胺通过改变ST1M1和ST1M2的比率而调控TRPC1介导的Ca~(2+)信号;[Ca~(2+)yt增加则激活下游的Rho-GTPases,MLC磷酸化增加,刺激应力纤维形成和细胞骨架重排而促进细胞迁移。本课题组前期研究发现益气健脾方药如白术、党参、黄芪、甘草提取物(多糖、黄酮提取物等)及四君子汤糖等可促进IEC-6细胞迁移,作用机制与其影响多胺信号通路有关,其中Ca~(2+)调控是关键指标。研究目的筛选药效活性较高的黄芪多糖组分为受试药,观察其对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移过程多胺信号通路(尤其是Ca~(2+)调控指标)的影响,探讨益气健脾中药黄芪促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制及药效物质,为其临床治疗胃肠黏膜损伤的疗效机制提供参考。研究方法1.黄芪多糖提取、分离和纯化:黄芪药材经水提醇沉法、Sevag去蛋白、DEAE-52纤维素柱层析、Sephadex葡聚糖柱层析,分别得到黄芪多糖1、2、3、4样品;苯酚-硫酸法测定黄芪多糖各样品的多糖含量;高效液相色谱法进行黄芪多糖3、4样品纯度分析。2.在细胞迁移模型筛选受试药:划痕法IEC-6细胞迁移模型观察黄芪多糖4种样品对细胞迁移的影响,筛选出促进细胞药理活性最佳的多糖样品为后续研究受试药。3.作用机制指标检测:①RT-qPCR测定TRPC1、STIM1、STIM2mRNA表达。② Western Blot 检测 Kv1.1、TRPC1、STIM1、STIM2、RhoA、Rac1、Cdc42 蛋白表达。③流式细胞仪测定细胞膜电位(Em)、细胞质内游离钙离子水平([Ca~(2+)]cyt)。④免疫荧光法检测STIM1蛋白表达及分布。⑤免疫沉淀法检测STIM1/TRPC1、STIM1/STIM2复合体蛋白表达。研究结果1.黄芪多糖提取、分离和纯化:①黄芪多糖1、2、3、4的得率分别为:5.64%、3.34%、1.50%、6.5‰。②黄芪多糖 1、2、3、4 的多糖含量分别为 31.0%、50.9%、66.3%、45%。以"黄芪多糖3"多糖含量最高。2.黄芪多糖各样品对细胞迁移的影响:黄芪多糖4种样品均能促进细胞迁移,以"黄芪多糖3"促进细胞迁移药效最佳,故确定为后续实验受试药。实验剂量设为:20mg/L~160mg/L。3."黄芪多糖3"(以下简称"黄芪多糖")对细胞迁移的影响:黄芪多糖能促进细胞迁移,逆转DFMO(多胺合成抑制剂)对细胞迁移的抑制,提示黄芪多糖促进细胞迁移的作用与其提高细胞内多胺含量有关。4.黄芪多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca~(2+)调控的影响(1)对Ca~(2+)调控上游指标的影响:①提高钾通道蛋白Kv1.1表达;逆转DFMO对Kv1.1表达的抑制;②提高细胞膜电位超极化水平,逆转DFMO所致的膜电位去极化。提示黄芪多糖可通过激活钾通道和提高细胞膜电位而增加Ca~(2+)内流驱动力。(2)对Ca~(2+)调控指标的影响:①促进胞内Ca~(2+)感应器STIM1蛋白移位至细胞浆膜,改善DFMO对STIM1移位的抑制,提高STIM1在细胞膜的表达;②提高STIM1 mRNA和蛋白表达,逆转DFMO对STIM1 mRNA和蛋白表达的抑制;减少Ca~(2+)负调控因子STIM2 mRNA和蛋白表达;抑制DFMO所致的STIM2 mRNA和蛋白表达的升高。③增加TRPC1/STIM1复合体蛋白表达,减少STIM1/STIM2复合体蛋白表达;增加DFMO负荷时TRPC1/STIM1复合体中TRPC1、STIM1蛋白表达;减少DFMO负荷下STIM1/STIM2复合体中STIM2蛋白表达。提示黄芪多糖可通过调节胞内钙库Ca~(2+)感应指标进而影响TRPC1介导的Ca~(2+)信号。(3)对钙通道蛋白和[Ca~(2+)]cyt的影响:①提高钙通道蛋白TRPC1mRNA和蛋白表达,减少DFMO所致的TRPC1 mRNA和蛋白表达抑制;②提高[Ca~(2+)]cyt,逆转DFMO所致的[Ca~(2+)]cyt降低;若去除细胞外Ca~(2+)内流途径(使用无钙培养液),则不但无钙对照组细胞迁移数显著减少,且黄芪多糖促进细胞迁移的作用也明显减弱。提示黄芪多糖可通过增强TRPC1介导的Ca~(2+)内流、提高[Ca~(2+)]cyt而促进细胞迁移。(4)对Ca~(2+)调控下游指标的影响:提高Rho-GTPase(RhoA、Rac1、Cdc42)蛋白表达;逆转DFMO对RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表达的抑制。提示黄芪多糖可通过提高Ca~(2+)调控下游指标Rho-GTPase而促进细胞迁移。研究结论黄芪多糖是黄芪促进细胞迁移的有效组分之一,作用机制与其影响细胞迁移多胺信号通路有关,尤其Ca~(2+)是关键调控指标之一,可通过调节[Ca~(2+)]cyt上下游相关指标促进细胞迁移。研究结果为探讨益气健脾中药黄芪胃肠黏膜损伤修复机制提供了参考。


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