基于DKK-1/Sost/Wnt信号通路研究补肾健脾活血方防治骨质疏松的骨保护机制

【摘要】：目的1、临床研究选择证型是脾肾阳虚型的老年女性原发性骨质疏松症患者,通过观察患者疼痛情况(VAS评分)以及血清骨代谢标志物β-1型胶原羧基端肽(β-CTx)、N-端骨钙素(N-MID)和总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(T-PINP)、DKK-1和Sost的含量变化,来观察补肾健脾活血方治疗骨质疏松症的临床疗效。2、基础实验采用补肾健脾活血方干预过由表达DKK-1,Sost腺病毒转染的成骨细胞,通过观察细胞的活性,钙离子的浓度,ALP活性,及BMP2、CTGF、FGF的表达,研究补肾健脾活血方治疗骨质疏松的分子生物学机制。方法1.临床研究①临床研究选择广州中医药大学附属骨伤科医院接收的原发性骨质疏松症老年女性患者40例,将患者分成对照组和治疗组,对照组给予口服钙尔奇D及骨化三醇胶丸;治疗组在与对照组相同给药的基础上,加服汤剂补肾健脾活血方。②所选取的研究对象在给药的前一天早晨及治疗结束后的第二天早晨,空腹采集静脉血,取出血清,用酶联免疫分析法评价其标志物N-MID、β-CTx和T-PINP、DKK-1和Sost水平变化;观察用药前、后疼痛视觉模拟评分(VAS评分)。2、基础实验研究将培养细胞分成NC对照组,Ad-DKK-1组,Ad-Sost组,Ad-DKK-1+Ad-Sost组。NC对照组用空载腺病毒转染;Ad-DKK-1组由包装过表达DKK-1腺病毒转染;Ad-Sost组由包装过表达Sost腺病毒转染;Ad-DKK-1+Ad-Sost组由包装过表达DKK-1腺病毒和包装过表达Sost共转染。每组分别用含药血清和空白血清干预,采用CKK-8检测细胞增殖,ALP活性检测试剂盒检测ALP活性,流式检测细胞钙离子浓度,蛋白印记检测BMP2、CTGF、FGF的表达。成果1.临床研究①对照组和实验组的一般资料资料(包括年龄、体重、身高、BMI和骨密度)都以均数±标准差来描述,先用正态性检验分析数据,表明数据符合正态分布,组间比较用t检验来描述。用Levene方差齐性检验各组方差齐性,实验组与对照组比较无统计学差异。两组间无统计学差异,具有很好的可比性。②骨代谢指标检测β-CTx、N-MID、T-PINP、DKK-1和Sost在实验前方差齐,两组无统计学差异。两组经药物治疗后,β-CTx的表达量显著减低,但实验组和治疗组治疗后无统计学差异(t=0.614,P=0.543),与使用了中药补肾健脾活血方的实验组相比,对照组的降低趋势更大一些;N-MID的表达量未见明显变化,但都有升高的趋势;T-PINP、DKK-1和Sost的表达量未见明显变化,但都有降低的趋势。③VAS评分显示在治疗前两组患者的疼痛程度无明显差异(t=0.831,P=0.411),经药物治疗后,两组的疼痛症状都得到改善,实验组的疼痛较对照组改善的更明显(t=5.068,P=0.000)。2.实验研究①各组细胞活性变化与空白血清分别干预的四组比较,含药血清分别干预后的四组,在24h,48h,72h的细胞活性都增强;②各组细胞ALP活性变化与空白血清干预的四组相比,含药血清干预的四组活性都有提高(P=0.029,P=0.015,P=0.041,P=0.029),当DKK-1、Sost过表达分别转染细胞及共转染细胞后,ALP活性变化趋势更明显;③各组细胞钙离子变化与空白血清分别干预的Ad-DKK-1组,Ad-Sost组,Ad-DKK-1+Ad-Sost组三组比较,含药血清分别干预的Ad-DKK-1组,Ad-Sost组,Ad-DKK-1+Ad-Sost组的钙离子浓度降低(P=0.026,P=0.035,P=0.002),在NC对照组中空白血清与含药血清的干预无明显差异(P=0.108);④各组细胞骨相关蛋白的变化在蛋白印记检测中,BMP2在含药血清干预的四组的相对表达量较空白血清干预的四组的相对表达量高(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.001),在观察CTGF的相对表达量中,含药血清分别干预的Ad-DKK-1组,Ad-Sost组,Ad-DKK-1+Ad-Sost组,三组的相对表达量较空白血清分别干预的Ad-DKK-1组,Ad-Sost组,Ad-DKK-1+Ad-Sost 组的表达量有增加(P=0.000,P=0.000,P=0.000),在 NC 对照组中含药血清干预与空白血清干预无明显差异;在观察FGF相对表达量中,含药血清分别干预的Ad-DKK-1组,Ad-Sost组,Ad-DKK-1+Ad-Sost组,三组的相对表达量较空白血清分别干预的Ad-DKK-1组,Ad-Sost组,Ad-DKK-1+Ad-Sost组的表达量增加(P=0.000,P=0.000,P=0.000),在NC对照组中含药血清干预与空白血清干预降低(P=0.047),在DKK-1和Sost过表达及共过表达的细胞中,含药血清干预后与空白血清比较蛋白的变化更明显。结论1、临床研究中,实验组和对照组N-端骨钙素(N-MID)、总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(T-PINP)、DKK-1和Sost治疗前后未见明显差异,但是β-Ⅰ型胶原羧基端肽(β-CTx)在对照组和实验组治疗前后有统计学意义,然而治疗后两组无统计学意义。2、在VAS评分中治疗后都有统计学差异,尤其实验组在改善疼痛方面的效果更好。3、补肾健脾活血方含药血清可以提高细胞活性,降低钙离子浓度,抑制细胞的凋亡,提高ALP的活性,提高BMP2、CTGF、FGF的相对表达量,有利于成骨细胞的矿化,尤其在过表达DKK-1和过表达Sost干预后。补肾健脾活血方可能通过调控DKK-1和Sost进而影响成骨细胞的代谢。