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基于外泌体miRNAs探索慢性萎缩性胃炎血清标记物及胃萎清干预机制

刘洪  
【摘要】:目的:慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophy gastritis,CAG)是消化科常见疑难病,属于慢性胃炎的一种,以胃镜下黏膜活检提示胃黏膜固有腺体减少,伴或不伴有肠上皮化生及异型增生为诊断依据。其诊断手段单一,可接受性较差,加上缺乏有效、准确的血清学指标,这大大阻碍了CAG相关研究工作的开展。CAG作为胃癌前疾病,其治疗目前以改善症状和营养胃黏膜为目标,西医没有特效药物逆转萎缩、肠化、异型增生。中医药可以逆转萎缩的机制正在不断探索中。因此,本研究以外泌体miRNAs为切入点,寻找CAG血清标志物,探索具有健脾理气、化瘀解毒功效中药复方胃萎清治疗CAG的疗效机制意义重大,有望用于临床工作。方法:1.临床研究筛选阶段:收集CAG与正常对照者(CNAG)临床病理资料及血清、胃黏膜组织样本;采用Exo Quick提取血清外泌体,纳米追踪技术(NTA)、流式细胞技术对其进行鉴定;采用高通量测序技术,分析两组人群血清外泌体中s RNAs的表达情况(s RNA-seq);根据表达丰度与显著差异初步筛选出候选miRNAs,通过受试者工作特征曲线(ROC)分析评估其诊断价值,同时对其进行生物信息学分析。2.临床研究验证阶段:通过qRT-PCR技术验证候选miRNAs,同时采用ELISA试剂盒检测CAG已知血清标志物胃泌素(GAS)、胃蛋白酶原(PG I、II)等,通过ROC分析评价及比较它们的诊断价值,得到具有诊断价值的生物标志物及关键miRNAs;再根据胃黏膜病理组织学指标分级,对关键miRNAs的表达情况进行分析;最后对关键miRNAs用RNAhybrid,miRanda和Target Scan进行靶基因预测,及检测胃黏膜组织中关键miRNAs及可能的靶基因。3.胃萎清干预及机制探索:在现有的胃萎清干预研究基础上,以病理组织学为主要疗效评价指标、叶酸为对照组,评价其干预脾虚型CAG的临床疗效;通过q RT-PCR技术对治疗前后血清外泌体、胃黏膜组织中关键miRNAs及靶基因的表达进行检测,探索胃萎清作用机制。结果:1.通过对CAG与CNAG两组各30名受试者性别、年龄进行比较,无统计学差异,具有可比性。对提取的血清外泌体进行鉴定,结果显示6个样品中70%左右粒径大小在20nm-200nm,粒子分布系数(PDI)在0.08-0.7之间,表面标志物CD81、CD63阳性比均在80.0%以上,可知采用Exo-Quick试剂盒制备的外泌体沉淀富含外泌体,但不能排除含有其他胞外囊泡,可用于后续研究。然后,s RNA-seq结果示每个样本获得平均37,000,000条reads,约50.2%可以比对至基因组,其中miRNAs占42.4%;大于10reads/样共有220 miRNAs,分别来自111个不同的pre-miRNAs,其中包括7个新的mir。表达量最多的前10个miRNAs是hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-122-3p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-320a。hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p在CAG组中表达明显上调,具有显著差异;hsa-miR-451a、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p显著下调;因此将它们定义为候选miRNAs。ROC分析提示,最有潜力的是hsa-miR-3591-3p(AUC 1.00,95%CI:1-1,P=0.049),100%特异性和100%敏感性;其次是hsa-miR-122-5p(AUC 0.78,95%CI:0.36-1,P=0.28)、hsa-miR-122-3p(AUC 0.56,95%CI:0.03-1,P=0.83)。因测序样本量太少,无法对这6个候选miRNAs组合进行ROC分析。6个候选miRNAs其靶基因进行GO显著性富集分析结果显示主要集中在生物过程:cellular process、细胞成分:cell、cell part,分子功能:binding。靶基因富集最多的pathway通路Signal transduction、Cancers:Overview、Global and overview maps、Endocrine system、Immune system。靶基因富集程度最大的是Protein processing in endoplasmic reticulum、Neurotrophin signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis。因此,可以发现这些候选miRNAs主要与细胞成分、免疫反应相关。2.采用Elisa试剂盒检测CAG与CNAG组受试者血清样本中GAS、PG I、PG II的浓度,分别为(16.77,6.25)pg/m L vs(14.28,2.51)pg/m L、(83.92,71.73)ng/m L vs(64.86,102.62)ng/m L、(4.33,5.30)ng/m L vs(3.07,3.31)ng/m L、(22.05,16.93)vs(12.83,10.9),两组比较GAS、PG I/II有统计学差异。根据s RNA-seq结果,选取CNAG、CAG每组各30个样,对6个候选miRNAs进行验证。结果表明,在两组比较中,s RNA-seq结果中最具潜力的hsa-miR-3591-3p存在表达量较低、纳入实际分析的病例数偏少、表达趋势不一致的问题;hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p表达趋势与s RNA-seq结果一致,明显上调,但hsa-miR-122-3p存在表达量偏低、Ct值偏大实际纳入分析的病例数偏少的问题。另外,hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-451a表达无明显差异。ROC曲线显示了其中GAS、PG I/II、hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p所对应的曲线下面积(AUC)分别为0.74、0.67、0.76、0.67,诊断价值明显高于单一其他指标,具有一定的区别CAG患者与正常对照人群的能力;GAS、PG I、PG II、PG I/II最佳临界值分别为16.13、53.18、5.45、23.84。hsa-miR-122-3p、hsa-miR-3591-3p均因纳入分析病例数过少,可信度稍差。利用Logistic回归对它们进行合并建模,组合8为GAS、PG I/II、hsa-miR-122-5p AUC为0.84(95%CI:0.74-0.94),敏感性和特异性分别为67.86%、89.66%,诊断价值最佳。根据s RNA-seq和RT-q PCR结果,证实hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p在CAG组受试者血清外泌体中表达显著上调,两者相关性分析提示呈正相关(r=0.92,P0.05),将它们定义为关键miRNAs。依胃黏膜病理组织学指标分级,对关键miRNAs的表达情况进行分析,结果表明hsa-miR-122-5p在中度与重度萎缩中可能表达下调,另外可能随着肠化程度的严重程度,hsa-miR-122-5p表达升高,与异型增生、慢性炎、活动性无明显相关性;hsa-miR-122-3p在不同病理学指标中均未呈现出差异表达。因此,hsa-miR-122-5p在血清外泌体中的表达,可能与萎缩、肠化有关,而hsa-miR-122-3p在血清外泌体中的表达较不稳定,其可靠性不hsa-miR-122-5p。最后hsa-miR-122-5p在CAG组胃黏膜组织中明显低表达,且有统计学意义,其ROC分析结果与血清结果一致;靶基因预测结果中挑选6个可能与CAG发病相关的靶基因,进一步验证发现CAG组CCLN、OLCN、SLC7A1、PIGS表达变化不明显,而NOD2表达明显下调,P值为0.09,趋近于有统计学差异,与胃黏膜组织中miR-122-5p保持一致的趋势,与血清外泌体中miR-122-5p保持相反的趋势;SLC1A5也表现出整体下调趋势,P值为0.14。3.检索自建数据库,共有64例患者完成研究,其中胃萎清组38例,叶酸组26例。入组前临床病理特征分析无统计学差异,基线资料一致,具有可比性。与治疗前比较,所有入组患者萎缩、慢性炎及病理总积分明显减少。胃萎清组治疗后,萎缩、慢性炎减少,提示胃萎清治疗可能主要起逆转萎缩、减轻炎症的作用;叶酸组治疗后,萎缩明显减少,提示叶酸可能起逆转萎缩的功效。胃萎清与叶酸在改善患者病理积分、异型增生消失率、病理组织学指标改善率上的疗效相当。通过q RT-PCR对部分受试者血清外泌体中hsa-miR-122-5p、胃黏膜组织miR-122-5p、靶基因NOD2、SLC1A5进行检测,结果提示治疗后较治疗前血清外泌体中hsa-miR-122-5p呈现轻微下调趋势,胃黏膜组织NOD2、miR-122-5p呈现上调趋势;与无效组比较,有效组血清外泌体hsa-miR-122-5p下调,胃黏膜组织NOD2、SLC1A5上调;与叶酸组比较,胃萎清组治疗后血清外泌体中hsa-miR-122-5p呈现下调更明显;胃黏膜组织中NOD2上调明显。结果均无统计学差异,但与治疗后胃黏膜病变好转,血清外泌体hsa-miR-122-5p下调、靶基因NOD2上调的变化趋势假说一致。故胃萎清组可能作用于miR122/NOD2。结论:血清外泌体hsa-miR-122-5p具有作为非侵入性CAG诊断标志物的潜力,可以有效区分慢性萎缩性胃炎和正常人群或慢性非萎缩性胃炎人群;其表达变化趋势与胃黏膜中不一致,其来源尚不确定,与萎缩、肠化相关,其可能的靶基因是NOD2。与GAS、PG I/II组成的新分子标签对于CAG具有很好的诊断效能;健脾理气、化瘀解毒中药胃萎清治疗CAG可能是通过hsa-miR-122-5p/NOD2调控网络逆转胃黏膜萎缩或减轻炎症反应。而其他候选miRNAs:hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-122-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-451a、hsa-miR-3591-3p尚需更大临床样本量来检验其表达差异及诊断价值。


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