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川续断皂苷Ⅵ调控滋养细胞PR、PSG1及凋亡机制研究

杜鑫  
【摘要】:自然流产(SA)是指临床妊娠28周以前发生的流产,是妇产科常见的生殖障碍疾病,其中早期自然流产是指临床妊娠12周以前发生的流产。一直以来,学术界对自然流产的研究从未间断,尤其随着国家全面开放二胎政策,自然流产的发病率逐渐增加,其发病机制尚未完全明确。滋养细胞在早期妊娠起到重要作用,有很多研究表明滋养细胞功能的失调可导致自然流产,如滋养细胞侵袭功能不足易引发自然流产,其凋亡增多及增殖不足则可导致自然流产的发生,因此滋养细胞作为研究自然流产机制的常用细胞。孕激素在临床上是妊娠后常规检测的指标,孕酮是临床治疗先兆流产的常用药物,而孕酮功能的发挥离不开PR,因此PR在早期妊娠中有重要意义。妊娠特异蛋白(PSG)是在妊娠期间由细胞和合体滋养细胞产生的,它是一个蛋白家族,其中PSG1是课题组前期通过基因芯片筛选SA患者及正常早孕者绒毛组织中有明显差异的一个基因。寿胎丸是临床常用于补肾安胎的药物,其中续断是安胎药物代表,课题组前期研究川续断皂苷Ⅵ在蜕膜细胞中可以通过Notch通路提高PR表达。因此基于课题组前期研究,本课题选用美国ATCC细胞库中人的早期妊娠滋养细胞株HTR8/Svneo进行细胞功能的实验,主要研究川续断皂苷Ⅵ是否对流产模型滋养细胞的凋亡功能有影响,以及滋养细胞中PR、PSG1表达是否与凋亡有关,从而解释自然流产的机制。目的:研究自然流产患者绒毛组织与正常早孕人工流产者绒毛组织的PR、PSG1、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达差异,用米非司酮(RU486)诱导HTR8/Snveo滋养细胞构建流产及凋亡状态模型,探讨川续断皂苷Ⅵ对自然流产模型的滋养细胞PR、PSG1的表达及凋亡功能的影响,同时探讨PR、PSG1与Akt通路及凋亡的调控关系,并明确川续断皂苷Ⅵ对PR、PSG1表达的影响。方法:1.体内研究。通过qRT-PCR、WB实验方法进行临床筛查及验证绒毛组织中PR、PSG1及凋亡的基因、蛋白表达差异。2.体外研究。RU486诱导滋养细胞流产与凋亡模型的建立。采用不同浓度RU486诱导滋养细胞不同时间,通过CCK8增殖-凋亡实验、流式细胞术、Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡情况,通过WB检测PR、PSG1、p-Akt及凋亡蛋白表达情况,以确定模型的建立。川续断皂苷Ⅵ对SA模型滋养细胞的PR、PSG1及凋亡的表达影响。基于RU486诱导滋养细胞自然流产及凋亡模型,通过CCK8、Annexin V/PI染色、Hoechst33258荧光染色检测川续断皂苷Ⅵ对滋养细胞凋亡的影响,通过WB检测川续断皂苷Ⅵ对模型滋养细胞PR、PSG1、p-Akt及凋亡蛋白表达的影响。PR、PSG1通过PI3K/Akt通路调控凋亡的机制。通过转染PR si RNA、PSG1 si RNA,采用qRT-PCR方法检测转染效率,同时观察PR、PSG1及凋亡基因表达变化,并采用WB方法观察滋养细胞PR、PSG1及凋亡蛋白的变化。抑制PI3K/Akt,采用WB方法观察滋养细胞PR、PSG1及凋亡蛋白的变化。川续断皂苷Ⅵ对PR、PSG1蛋白的靶向作用影响。通过川续断皂苷Ⅵ分别作用于已转染PR si RNA和PSG1 si RNA的细胞,采用WB检测对应转染后细胞的PR、PSG1蛋白表达。结果:1.体内研究。SA患者绒毛组织中PR、PSG1表达减少,Akt通路下调,Bcl-2表达下调,Bax表达上调。qRT-PCR检测SA患者的绒毛组织中PR、PSG1、Bcl-2 m RNA较正常早孕人工流产患者的绒毛组织的表达显著降低,Bax m RNA显著增多,差异均具有统计学意义(P0.001)。WB检测SA患者的绒毛组织中PR、PSG1、p-Akt、Bcl-2蛋白较正常早孕人工流产患者的绒毛组织的表达显著降低,Bax蛋白显著增多,差异均具有统计学意义(P0.05)。2.体外研究。RU486诱导滋养细胞流产与凋亡模型的建立。通过CCK8、流式细胞术、Hoechst33258荧光染色、WB等实验方法,将不同浓度RU486作用于HTR8/Svneo滋养细胞不同时间,造成自然流产及凋亡模型。各检测方法均说明RU486作用滋养细胞浓度越大,时间越长,细胞生长活力越低,早期及总凋亡率越高,妊娠蛋白PR、PSG1表达降低,促凋亡蛋白Bax表达增多,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,PI3K/Akt通路受到抑制,差异均具有统计学意义(P0.05)。因此,RU486可降低滋养细胞PR、PSG1表达,抑制Akt通路而促进凋亡发生,建立造模方法成功。最终得到RU486造模最佳浓度为50μmol/L,CCK8、Annexin V/PI双染色流式细胞术、Hoechst33258染色实验检测造模最佳时间均为24h,WB检测蛋白造模最佳时间为8h。川续断皂苷Ⅵ对SA模型滋养细胞PR、PSG1及凋亡表达的影响。通过CCK8、Annexin V/PI双染色流式细胞术、Hoechst33258荧光染色、WB实验方法,将川续断皂苷Ⅵ作用于RU486诱导流产及凋亡模型的滋养细胞中,各检测方法的结果均显示ASA VI可以增加滋养细胞生长活力,降低早期凋亡率,差异均具有统计学意义(P0.05)。川续断皂苷Ⅵ可增加妊娠蛋白PR、PSG1表达,激活PI3K/Akt通路,并增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,降低促凋亡蛋白Bax表达,差异均有统计学意义(P0.05)。PR、PSG1通过PI3K/Akt通路调控凋亡的机制。转染PR si RNA后,Bcl-2、p-Akt蛋白表达减少,Bax蛋白表达增多,差异均具有统计学意义(P0.05),其中PSG1蛋白的变化无统计学意义(P0.05),则说明PR没有直接调控PSG1。转染PSG1 si RNA后,PR、Bcl-2、p-Akt蛋白表达减少,Bax蛋白表达增多,差异均具有统计学意义(P0.05),说明PSG1可调控PR的表达,进而通过Akt通路调控Bcl-2、Bax影响凋亡发生。抑制Akt后,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增多,差异均具有统计学意义(P0.05),说明Akt可调控滋养细胞凋亡功能。综上可知,PSG1可以调控PR表达,并通过Akt通路影响Bcl-2、Bax表达,从而影响滋养细胞的凋亡功能。结论:1.自然流产患者绒毛组织PR、PSG1蛋白表达降低,并出现明显的凋亡现象。2.RU486可以诱导HTR8/Svneo细胞构建体外自然流产模型,且RU486浓度越高,作用时间越长,HTR8/Svneo细胞生长活力越低,凋亡率越高,具有浓度依赖性和时间依赖性,其造模最佳浓度为50μmol/L。3.PSG1可以调控PR表达,PR可以激活Akt通路进一步调控Bcl-2、Bax表达,影响凋亡的发生。说明PSG1、PR对自然流产凋亡的发生起到重要作用。4.川续断皂苷Ⅵ可以促进模型细胞增殖,降低其凋亡率,同时靶向增加PSG1、PR表达,通过激活Akt信号通路上调Bcl-2表达、下调Bax表达起到防治流产及安胎的药理作用。


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