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补肾健脾活血方对Wnt通路抑制因子转染成骨细胞的影响

王吉利  
【摘要】:目的:1、观察补肾健脾活血方对成骨细胞ALP、OPG、OPN、BMP-2表达的影响;2、探讨补肾健脾活血方通过DKK1、Sost蛋白促进成骨细胞分化的作用机制;方法:1、中药干预原代成骨细胞,采用胰酶消化法提取原代成骨细胞(1)分别用空白血清、补肾健脾活血方高、中、低剂量血清,干预原代成骨细胞,采用CCK-8检测成骨细胞活性;(2)分别用空白血清、补肾健脾活血方中、低剂量血清、阿仑膦酸钠维D_3片(阳性药)血清干预原代成骨细胞,采用BCIP-NBT检测成骨细胞ALP表达;(3)分别用空白血清、补肾健脾活血方中剂量血清、阳性药血清干预原代成骨细胞,RT-qPCR检测OPG、OPN、BMP-2 mRNA表达,WB检测OPG、BMP-2蛋白表达;2、沉默DKK1、Sost腺病毒转染MG-63细胞,中药干预病毒转染细胞空载腺病毒、沉默DKK1腺病毒(sh-DKK1)、沉默Sost腺病毒(sh-Sost)、沉默DKK1腺病毒和沉默Sost腺病毒(sh-DKK1+sh-Sost)分别转染MG-63细胞:空白血清、含药血清分别干预腺病毒转染的MG-63细胞,ALP检测试剂盒检测ALP的活性、Calcium OtangeTM Indicators探针检测钙离子的浓度、WB检测BMP-2,CTGF、FGF2、Runx2,TNF-α蛋白表达;结果:1、补肾健脾活血方干预原代成骨细胞(1)在12h、24h、48h高、中、低剂量细胞活性呈上升趋势,72h后细胞活性呈下降趋势,与空白血清比较,中剂量血清在48h细胞活性最强。(2)含药血清ALP染色阳性率均比空白血清组高,中剂量含药血清ALP的染色率高于低剂量染色率和阳性药染色率。(3)与空白血清组比较,中剂量血清组可以提高OPG、OPN、BMP-2的mRNA的表达;与空白血清比较,阳性药物组可以降低BMP-2 mRNA的表达。(4)与空白血清组比较,中剂量血清组可以提高OPG、BMP-2蛋白的表达;与空白血清比较,阳性药组的OPG的表达降低。2、沉默DKK1、Sost腺病毒转染MG-63细胞,中药干预病毒转染细胞(1)分别在NC对照组、sh-DKK1组、sh-Sost组、sh-DKK1+sh-Sost组中,与空白血清干预比较,含药血清可以提高ALP活性。(2)分别在NC对照组、sh-DKK1组、sh-Sost组、sh-DKK1+sh-Sost组中,与空白血清干预比较,含药血清可以降低钙离子浓度。(3)NC对照组、sh-DKK1组、sh-DKK1+sh-Sost组分别与空白血清比较,含药血清可以提高各组中BMP-2、CTGF、FGF2、Runx2蛋白表达,降低TNF-α蛋白的表达;与空白血清比较,含药血清可以提高sh-Sost组中CTGF、FGF2、Runx2蛋白的表达,降低TNF-α蛋白的表达。结论:1、补肾健脾活血方干预原代成骨细胞,可以增加ALP的表达,增加OPG、OPN、BMP-2 mRNA,OPG、BMP-2蛋白的表达,促进成骨细胞分化。2、在沉默MG-63细胞中DKK1、Sost,同时补肾健脾活血方干预后;补肾健脾活血方可以提高ALP活性,降低钙离子浓度,提高BMP-2,CTGF,FGF2,Runx2蛋白表达,降低TNF-α蛋白表达。


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