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木犀草素抑制登革病毒成熟阶段的分子作用机制研究

彭敏桦  
【摘要】:目的:登革热是由登革病毒引起的经蚊媒传播的急性传染病。目前,登革热治疗无特效药物,中医药在临床上治疗登革热显示出较大优势。本课题主要研究从清热解毒中药紫花地丁中分离得到的化合物木犀草素的抗登革病毒作用并试图阐明其抑制作用机制。方法:1.木犀草素抗登革病毒的活性评价及其抑制病毒靶点研究:Cel Titer-Glo试剂盒检测木犀草素对Huh-7(人肝癌细胞系),BHK-21(幼年叙利亚地鼠肾细胞),Vero(非洲绿猴肾细胞),HEK-293T(人胚肾细胞)和A549(人非小细胞肺癌细胞)细胞的毒性;采用空斑法检测木犀草素对DENV 1-4病毒感染Huh-7细胞的病毒抑制作用。采用空斑法检测木犀草素对DENV 2病毒感染BHK-21、Vero、HEK-293T及A549等不同细胞的抑制作用。利用登革病毒感染PBMC的抗体依赖增强(ADE)模型,检测木犀草素抗ADE介导登革感染的活性。使用ELISA试剂盒检测木犀草素对受登革病毒感染的PBMC细胞释放的炎症因子IL-6的影响,评价其抗炎作用。以病毒E、NS3、NS5蛋白和病毒ds RNA为指标,采用间接免疫荧光法分析,从蛋白水平考察木犀草素对登革病毒的抑制作用。使用ADE-DENV-2病毒感染AG129小鼠致死模型,分析血清中病毒复制情况,评价木犀草素在体内的抗登革活性。采用空斑实验检测DENV-2病毒感染Huh-7细胞后不同时间(-2,0,2,6,12,24,48h)加入木犀草素的病毒复制情况,判断木犀草素抑制登革病毒增殖的时间阶段,考察木犀草素对登革病毒复制周期的影响。DENV-2病毒在Huh-7细胞里建立起感染后(即感染12小时后)加入木犀草素,收集感染后24、36、60小时的样本,使用实时荧光定量PCR仪分析细胞内和细胞外的病毒RNA水平、使用空斑法测定病毒滴度、使用western blot分析细胞上清液病毒蛋白成分,初步确定木犀草素作用于病毒的生命周期阶段、预测作用蛋白靶点。采用体外蛋白酶活性抑制实验探讨木犀草素对宿主furin蛋白和病毒NS2B/NS3pro抑制能力及预测其结合方式。采用Autodock软件分子对接技术对木犀草素与furin的结合方式进行预测。2.木犀草素耐药株的筛选及耐药机制研究:建立细胞模型,通过在逐渐增加木犀草素浓度的条件下对DENV-2病毒多次传代,筛选对木犀草素耐药的突变株,全基因测序确定病毒基因突变位点,评价木犀草素的耐药性及确定其对病毒的作用靶点。反向遗传法将突变位点引入感染性克隆,将重组的体外转录RNA电转染进C6/36细胞,获得病毒液供后续实验使用。将不同耐药突变株病毒感染Huh-7细胞,检测感染后6-48h病毒复制情况,评价耐药突变株的复制能力。DENV-2 wildtype及不同突变株病毒在Huh-7细胞里建立起感染后(即感染12小时后)加入木犀草素,收集感染后60小时的样本,使用空斑法测定病毒滴度、使用western blot分析上清病毒蛋白成分,考察木犀草素对不同耐药突变株的耐受性。体外模拟furin在高尔基体剪切不成熟病毒(不同耐药株)prM蛋白,使用western blot及间接免疫荧光分析木犀草素对prM蛋白剪切的抑制作用及其感染力,初步研究木犀草素对耐药株的耐药机制。结果:1.木犀草素抗登革病毒的活性评价及其抑制病毒靶点研究:在药物浓度为0.01~100μM范围内,木犀草素在Huh-7、HEK-294T、BHK-21细胞的毒性相似,CC_(50)分别是45.89、38.89、34.73μM;在A549和Vero细胞的毒性相似,CC_(50)为分别是93.64和大于100μM。木犀草素对不同血清型登革病毒具有显著抗病毒作用,以剂量-效应依赖方式抑制DENV 1-4,EC_(50)分别为4.36、5.19、5.69和8.38μM,选择指数(SI)分别为6.37、8.84、8.07和5.48。木犀草素在不同的细胞系上也能抑制DENV-2,包括A549、HEK-293T、BHK-21和Vero细胞,EC_(50)分别为39.16、12.26、14.04和9.36μM,SI分别为2.39、3.17、2.47和10.68。SI均大于2,表明木犀草素抗登革病毒效能为低毒高效。木犀草素对抗体依赖增强介导的登革病毒感染PBMC细胞具有抑制作用,以剂量-依赖方式抑制ADE-DENV-1,EC_(50)为15.61μM、SI为3.23,SI大于2,表明木犀草素抗登革病毒效能为低毒高效。木犀草素能抑制病毒感染宿主细胞分泌的炎症因子IL-6,表明木犀草素可有效调节炎症因子的分泌。间接免疫荧光结果表明木犀草素在浓度为10μM时能一定程度上减少登革病毒ds RNA的合成及E、NS3、NS5蛋白的表达,抑制率为50%左右,表明木犀草素可能通过其它途径阻碍登革病毒的增殖。分别在感染前2小时和0、2、6、12、24、48小时加入木犀草素,在感染时加入木犀草素效果最显著;在感染24小时后即病毒已完成第一轮增殖,加入木犀草素依然能有效减少感染性病毒颗粒的释放,表明木犀草素可能主要影响病毒生命周期的后期阶段如包装、成熟、释放及阻碍病毒的二次感染。在感染12小时后才加药,分析木犀草素对病毒复制不同时间的影响。木犀草素处理组的细胞内外病毒RNA水平和病毒对照组的无显著差异,但是木犀草素处理组上清液病毒滴度相比病毒对照组显著减少(60 h p.i,减少15.5倍),释放的病毒颗粒含有更多的prM蛋白,提示木犀草素处理组细胞分泌的病毒颗粒大多是携带prM蛋白、不成熟且不具有感染性。一天4次、每次100mg/kg的木犀草素剂量未能保护DENV-2感染小鼠死亡,也不能降低血清中病毒RNA水平,但是空斑实验测定的病毒滴度(感染性病毒颗粒水平)在第3天却比对照组减少2倍,*P0.05,表明木犀草素也能在体内抑制成熟登革病毒的释放,体内体外数据具有一致性。体外蛋白酶活性抑制实验表明木犀草素抑制宿主furin的剪切活性呈剂量依赖型,在浓度为200μM能达到大于95%的抑制作用,木犀草素对furin是反竞争抑制剂,抑制常数Ki为58.6μM。木犀草素抑制病毒NS2b-NS3pro的切割活性呈剂量依赖型,在浓度为200μM能达到约65%的抑制作用。木犀草素对NS2b-NS3pro为非竞争抑制剂,抑制常数Ki为140.36μM,抑制能力比较弱。通过分子对接技术预测木犀草素与furin的N310、Q488的侧链和G265的酰胺键以中等至弱的静电相互作用结合,与P-结构域的W531以疏水作用结合。木犀草素与P结构域的b3和b6、及催化结构域灵活的环区a4、b5和b6结合破坏了P domain的稳定性,并使底物结合不稳定。2.木犀草素耐药株的筛选及耐药机制研究:P10代病毒液出现了木犀草素耐药突变株,分别在prM蛋白79位由酪氨酸T突变为精氨酸R、在NS2B蛋白114位由异亮氨酸I突变为蛋氨酸M,PrM T79和NS2B I 114在DENV1-4中均为高度保守,保守率分别是100%和98.15%-100%。反向遗传法获得耐药突变株(prM T79R,NS2B I114M,prMT79R-NS2B I114M),体外转录RNA电转染进C6/36细胞,将上清液获得的耐药突变株病毒液感染Huh-7细胞,与DENV-2 wildtype相比,prM T79R突变株复制得比较慢,NS2B I114M复制得比较快,而prMT79R-NS2B I114M的复制情况与WT相似。同样的,在突变株感染Huh-7细胞12小时后才加木犀草素,感染60小时后的相对病毒滴度分别为9.78%(WT)、41.19%(prM T79R)、33.20%(NS2B I114M)和54.10%(prM T79R-NS2B I114M)。各突变株经木犀草素处理后含有比WT更少的prM蛋白,表明prM T79R、NS2B I114M及prM T79R-NS2BI114M突变株均能减少对木犀草素的耐受性。木犀草素可在胞外抑制furin对WT或NS2B I114M突变株prM蛋白的切割,可部分抑制对prM T79R(减少73%)和prM T79R-NS2B I114M(减少87%)突变株prM蛋白的切割。木犀草素不能恢复WT或NS2B I114M不成熟病毒的感染力,可部分恢复prM T79R和prM T79R-NS2B I114M突变株的感染力。结论:木犀草素在Huh-7细胞上能抑制4种不同血清型登革病毒,半数有效浓度具有相似性,提示木犀草素对不同血清型的登革病毒作用靶点可能是同一种成分或者相同的通路。木犀草素在不同的细胞系上具有不同的抗病毒效能,在HEK-293T、A549和BHK-21上相似,在Huh-7和Vero细胞上相似。木犀草素的抗病毒作用也适用于抗体依赖增强介导的登革病毒感染,并能在一定水平上抑制IL-6的分泌,从而抑制病毒感染导致的细胞因子分泌失调,减轻炎症损伤。木犀草素也能抑制登革病毒感染AG129小鼠体内感染性病毒颗粒的生成,体内体外实验数据具有一致性。木犀草素能减少第二轮感染性病毒颗粒的释放,可能主要影响病毒生命周期的后期阶段。木犀草素虽然不能抑制病毒RNA复制和蛋白的合成,但是可以减少感染性病毒颗粒的释放,阻止prM向M蛋白的转化从而抑制病毒的成熟阶段。宿主furin及病毒NS2B/NS3与病毒的成熟阶段相关,木犀草素对furin是反竞争抑制剂,对NS2B/NS3是较弱的非竞争抑制剂。耐药突变株的筛选确定编码PrM和NS2B病毒蛋白的两个基因产生突变:prM T79R和NS2B I114M。反向遗传法将突变位点引入感染性克隆获得耐药突变株,prM T79R突变株的复制能力比WT弱,而NS2B I114M突变株的复制能力比WT强,prM T79R-NS2B I114M突变株与WT的复制能力相当。PrM T79R和NS2BI114M突变对病毒复制能力具有补偿作用,不同突变株复制能力不同的机制有待进一步研究。PrM T79R或NS2B I114M突变点均对木犀草素减少敏感性,木犀草素对furin蛋白酶切活性的抑制可能涉及到宿主furin和不成熟的病毒颗粒交界面的相互作用,其允许病毒通过使关键的氨基酸突变、改变交界面的结构,从而使得病毒逃逸木犀草素的抑制作用。综上,木犀草素抑制furin的活性可能是通过调控furin和prM蛋白之间的结合界面及与NS2B/NS3相互作用,揭示了病毒成熟过程的可塑性。通过干扰宿主furin蛋白酶活性及与病毒prM和NS2B蛋白相互作用来抑制病毒的成熟阶段是潜在的抑制登革病毒感染的靶标。


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