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乳腺癌差异miRNA和相关lncRNA筛选、验证及其功能研究

许家瑞  
【摘要】:目的:乳腺癌是全世界女性发病率最高的癌症之一,我国癌症中心最新数据显示,乳腺癌新发病例数呈逐年上升趋势,乳腺癌早期患者5年生存率可达90%,而晚期患者5年生存率不足40%,乳腺癌已成为威胁女性身心健康的主要疾病,因此提高乳腺癌早期诊断比例、规范乳腺癌诊断治疗方法对乳腺癌防治有重要意义。本研究收集临床确诊乳腺癌患者组织、血清和正常体检人员血清,研究乳腺癌miRNA差异表达谱,并预测其靶lncRNA,通过体外细胞功能实验研究其功能机制,为乳腺癌诊断治疗及预后提供新的潜在生物标志物。方法:收集10例乳腺癌患者癌组织、癌旁组织、血清和10例正常人血清,利用高通量测序及TargetScan、Clip-seq、TCGA等数据库筛选出在乳腺癌中特异表达的miRNA;收集113名早期乳腺癌初诊病人以及91名健康对照女性血清,运用RT-qPCR,筛选出差异表达目的miRNA,设计合成miRNA模拟物mimics和抑制剂inhibitor,转染乳腺癌细胞 MDA-MB-231和T47D,通过 CCK-8检测转染 miRNA mimics 和 miRNA inhibitor后的乳腺癌细胞株增殖能力;通过Transwell检测转染miRNA mimics和miRNA inhibitor后的乳腺癌细胞株迁移能力;通过侵袭实验检测转染miRNA mimics和miRNA inhibitor后的乳腺癌细胞株侵袭能力;利用miRWalk,miRanda,RNAhybrid,Targetscan四种算法分别对目的miRNA进行靶lncRNA预测,并计算每个靶lncRNA的得分(即靶基因被不同算法所预测的总次数),对高可信的靶lncRNA取交集(得分≥3为高可信miRNA靶lncRNA),结合TCGA数据库,经单因素COX和Log Rank分析找到显著性最高的lncRNA,设计合成靶lncRNA过表达质粒和干扰质粒,构建稳定转染乳腺癌细胞株T47D,通过CCK-8、Transwell和侵袭实验等细胞功能实验研究其功能机制;通过lncRNA相关性分析,找到正相关的调控基因,选择相关性最高的前5个基因进行实验验证。结果:1.获得乳腺癌差异表达 miR-21-3p、miR-21-5p、miR-223-3p 和 miR-423-5p。2.定量分析血清中 miR-21-3p、miR-21-5p、miR-223-3p 和 miR-423-5p表达量,结果表明目的miRNA在血清中稳定表达;乳腺癌组与健康对照组相比,miR-21-3p、miR-21-5p、miR-223-3p和miR-423-5p相对表达量均上调,与前期测序结果表达情况一致;miR-21-3p、miR-21-5p、miR-223-3p,P0.001,差异均有统计学意义;miR-423-5p,P=0.284,差异没有统计学意义。3.乳腺癌细胞功能实验研究,我们发现对于乳腺癌细胞T47D,当上调细胞内miR-21-5p表达水平时,其增殖能力、迁移能力和侵袭能力均升高;下调细胞内miR-21-5p表达水平时,其增殖能力、迁移能力和侵袭能力均降低。当上调细胞内miR-223-3p表达水平时,其增殖能力、迁移能力和侵袭能力均升高;下调细胞内mmiR-223-3p表达水平时,其增殖能力、迁移能力和侵袭能力均降低。4.结合TCGA数据分析目的miRNA靶lncRNA预测结果得到显著性最高的长非编码MAPT-AS1;通过lncRNA相关性分析,得到正相关的调控基因MAPT、MAPT-IT1、SPPL2C、KDM4B、NXNL2用于实验验证。5.转染长非编码MAPT-AS1过表达及干扰细胞株T47D,荧光显微镜可见转染效率达90%以上,RT-qPCR验证显示成功构建长非编码MAPT-AS1过表达及干扰稳转乳腺癌细胞株T47D,并筛选出干扰效率最高的长非编码MAPT-AS1干扰片段shRNA3。细胞功能实验发现,过表达长非编码MAPT-AS1稳转细胞株的增殖、迁移和侵袭能力均升高,干扰稳转细胞株的增殖、迁移和侵袭能力则降低。RT-qPCR验证长非编码MAPT-AS1共表达基因,得到MAPT、MAPT-IT1和NXNL2在转染了 shRNA3干扰片段后表达量降低,与长非编码MAPT-AS1的表达趋势一致。结论:miR-21-5p和miR-223-3p在乳腺癌的发生发展中扮演着促癌基因的角色,能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭;其共同靶lncRNA-MAPT-AS1在乳腺癌患者中高表达,可能具有致癌作用,验证得到其共表达基因MAPT、MAPT-IT1和NXNL2与长非编码MAPT-AS1的表达趋势一致;miRNA、lncRNA和mRNA之间的相互作用机制可能在肿瘤发生发展中起关键作用,对于miRNA-lncRNA-mRNA调控网络的研究,将有助于更好的开发乳腺癌诊断和治疗策略。


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