补骨脂酚对BMSCs体外迁移能力的实验研究

【摘要】：目的:1.从SD大鼠股骨体外培养获得遗传稳定,表型一致的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并对其进行生物学鉴定。2.用补骨脂酚干预细胞,观察其对细胞增殖的影响,从而获得补骨脂酚对BMSCs药物毒性安全浓度区间。3.观察补骨脂酚对BMSCs细胞体外迁移的作用,进一步探讨补骨脂酚对BMSCs体外迁移过程中Wnt非经典通路Wnt5a/JNK的关系。方法:1.运用全骨髓贴壁法培养Sprague Dawley(SD)大鼠BMSCs,取生长状态良好的第3代(Passage 3)BMSCs行细胞表面抗原检测及三系分化诱导(成骨分化、成脂分化、成软骨分化)检测以鉴定。2.运用Cell Counting Kit-8(CCK8)法筛选补骨脂酚细胞毒性浓度。选取不影响细胞增殖的浓度进行下一步实验。3.运用细胞迁移小室实验观察不同浓度补骨脂酚对BMSCs细胞迁移效果的影响。4.运用蛋白质印迹法(Western-Blot WB)和细胞免疫荧光法观察补骨脂酚干预后BMSCs中Wnt5a蛋白表达5.运用sh-Wnt5a慢病毒载体敲除BMSCs中Wnt5a基因,运用观察绿色荧光蛋白表达以及聚合酶链锁反应(PCR)检测感染效率。得到sh-Wnt5a BMSCs细胞。6.选取补骨脂酚最佳促迁移浓度干预细胞,观察对比其迁移能力强弱,随后用PCR检测Wnt5a/JNK及其相关蛋白基因表达,进一步蛋白质印迹法从蛋白层面验证实验结果可靠性。结果:1.流式细胞检测细胞表面抗原标志物结果显示CD90、CD44、CD29表达阳性,其阳性率分别为98.58%、95.50%、97.63%;CD11bc、CD34、CD45表达阴性,其阳性率分别为0.47%、0.31%、0.24%。三系诱导分化结果显示实验所用细胞具有成骨,成脂及成软骨分化能力,从而进一步证明体外分离培养的细胞是BMSCs。2.用不同浓度梯度补骨脂酚刺激细胞,得出高浓度补骨脂酚(100 μ g/ml)抑制BMSCs增殖,但其结果不具有统计学意义,浓度小于等于50 μ g/ml补骨脂酚不影响BMSCs增殖。获得无明显抑制细胞增殖的药物浓度范围,设立浓度梯度进行细胞迁移实验。3.细胞迁移transwell实验结果显示与空白对照组相比较,25 y g/ml补骨脂酚促迁移效果最佳,结果差异具有统计学意义(P0.01);12.5μ g/ml补骨脂酚也促进BMSCs体外迁移(P0.05)。其余浓度补骨脂酚也可以促进BMSCs体外迁移,但结果无统计学差异。4.运用慢病毒转染细胞后,显微镜下观察绿色荧光蛋白表达阳性,PCR结果显示sh-Wnt5a BMSCs中Wnt5a表达量明显下降,结果具有统计学差异(P0.05).5.用含25 μmol/ml补骨脂酚完全培养基干预BMSCs以及sh-Wnt5a BMSCs,PCR、WB结果显示干预组Wnt5a、JNK蛋白表达量较空白完全培养基组增高。结论:补骨脂酚对BMSCs增殖无促进作用,且高浓度的补骨脂酚有细胞毒性。低浓度的补骨脂酚可以增强BMSCs迁移能力,其机制可能是通过激活Wnt5a/JNK信号通路从而促进细胞迁能力。