骨炎定对体外培养软骨细胞的影响

【摘要】： 骨性关节炎是中老年人的常见疾患，主要病理特征是关节软骨的退 变。关节软骨退变的原因尽管是多方面的，但软骨细胞的结构破坏和功 能丧失在其中起着至关重要的作用。采取有效方法保护软骨细胞的结构、 调节软骨细胞的功能是防止软骨退变的关键措施，是治疗骨性关节炎的 正确途径。陈基长教授研制的中药骨炎定（GUYANDING，GYD）能减 轻骨性关节炎的临床症状，改善关节功能。为了深入探讨其作用机理， 本实验采用软骨细胞培养技术观察其对软骨细胞代谢的影响。 实验一：关节软骨细胞的分离和培养 采用胶原酶Ⅱ分段酶消化法从三月龄大耳白兔的关节软骨中分离出 软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及 其生长情况，并用甲苯胺蓝异染色法进行细胞表型鉴定。结果表明，软 骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右，传代培养约4-5天，细胞以 圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实，细胞可合成蛋白多糖， 异染反应主要集中在细胞集落样生长区，异染程度以原代培养最为显 著。 实验二：骨炎定对培养兔软骨细胞增殖和蛋白质合成的影响 把传一代的软骨细胞接种于96孔培养板和24孔培养板中，培养24 小时后细胞贴壁进行分组试验。 1 MTT法测细胞增殖把96孔培养板中的32孔随机分为8组，每组4孔， 每孔培养体积0.1ml。A组（对照组）加用5％血清培养液；B-G组：分 别加用含有5％血清与1.25％、2.5％、5％、10％、20％、40％DMEM培 养液；AO组为空白调零组，未接种细胞，只加有含有5％血清的DMEM 广州中医药大学九八级骨科博士：杨运东 导师；陈基长 培养液。在培养48小时后用MIT ie检测细胞活性和增殖。结果GYD 组 5O、10o、20％骨炎定可促进软骨细胞增殖，与对照组相比，差别有 非常显著意义。 2考马斯亮蓝祛检测细胞总蛋白 24孔培养板随机分为六组，每组4孔，分别为：A组：空白对照组。 只加含有5％血清培养液；BS组分别加含有20％、10％、5％骨炎定、5％ 防风、5％当归注射液的培养液，培养三天后用考马斯亮蓝法检测细胞总 蛋白。结果表明：5％、10％、20％可促进软骨细胞总蛋白合成，与对照 组相比差别有非常显著性意义。炉仍刀l） 实验三：骨炎定对培养软骨细胞NOS和SOD的影响 把原代培养的软骨细胞接种于24孔培养板中，细胞贴壁生长后随机 分为6组并更换相应的培养液。A组（空白对照组人更换DMEM培养 液；B组（实验对照组）更换含有 100U／rnllN’－－的培养液滑卜骨＊组： 分别更换含有100、5o、2。50、1．25O骨炎定培养液（含有100UhaltwF）。 焙养刀小时后，收集各孔．上清液，用比色法检测NOS、SOD ％性。结 果表明，TN’－可使软骨细胞中的iNOS活性增加，5％骨炎定可显著提高 软骨细胞SOD ％性，抑制i：NOS活性。 实验四。骨炎定对培养软骨细胞超微结构的影响 传代培养的软骨细胞接种于8个培养瓶中，每瓶中预先置有盖玻片 一块。培养24小时细胞贴壁后培养瓶随机分为两组，对照组：更换含有 生理盐水的培养液。骨炎定组：更换含有5％骨炎定培养液。培养5天后， 取出小盛片，2，5％戊二醛固定后行扫描电镜观察。收集培养瓶中的细胞， 2．5％戊H醛固定后行透射电镜观察。结果：5％骨炎定组软骨细胞表面的 3 骨炎定对体外培养软骨细胞的影响 纤细突起和皱稻较对照组多，细胞表面的囊泡数少，透射电镜观察软骨 细胞胞浆丰富，线粒体和粗面内质网发达。超微结构的变化说明中药骨 炎定对软骨细胞有保护作用。 结论：本实验充分说明中药骨炎定可促进软骨细胞的增殖和蛋白质合成， 保护软骨细胞兔受肿瘤坏死因子等细胞因子的损害，可提高自由基清除 水平，调节软骨细胞的合成代谢，从而有效地保护软骨细胞，达到防止 软骨退变的日的。