通痹灵抗胶原诱导性关节炎分子免疫学机理探讨

【摘要】： 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性疾病，可导致进行的关节破坏，畸形，残疾和早逝。许多不同的途径在RA的发病机制中起着作用，当前RA治疗的低疗效特性正是这一状况的必然反映。对于RA的治疗，药物应当能很快地控制炎症，阻止关节破坏的进展，并可以安全地长时间使用。当前治疗RA的药物通常只能控制症状，如疼痛，肿胀，但对长远来看很难阻止关节破坏的进展，而且还有很多副作用。寻找新的治疗策略和开发新的药物因而成为药理工作者的一个持久的挑战。 中药的免疫调节作用研究是一个正迅速发展的领域，通痹灵以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成的，由15种中药组成，具有清热除湿、滋阴通阳、活血化瘀、通络止痛的功效。以往的研究表明，通痹灵对RA具有良好的临床治疗效果，毒副作用少，抗炎镇痛作用好，能降低模型动物抗胶原抗体效价，抑制关节骨质破坏，明显抑制滑膜成纤维细胞的增殖，降低AA大鼠滑膜细胞培养上清中IL-1、TNF-α的活性和PGE_2含量，下调滑膜中IL—1β，TNF-α mRNA表达。然而尚未对通痹灵的短期疗效和长期疗效进行系统的对比研究。本实验在前期研究的基础上，采用被广泛认可的小鼠CIA作为实验动物模型，进一步评价通痹灵的治疗作用，特别是抑制关节破坏的作用。 DBA／1小鼠胶原诱导性关节炎虽然不完全等同于人类RA，但同样以显著的滑膜炎及软骨和骨破坏为主要特征，已被证明是人类RA的极有价值的动物模型，它同人类RA在细胞免疫及体液免疫方面有着许多相似之处。自从它被首次描述以来，CIA作为一种强有力的研究工具广泛地用于研究关节炎免疫应答，分析基因易感因子，揭示炎症反应途径，以及开拓可能抗风湿药的治疗作用等方面。 氨甲蝶呤(MTX)一种改善病情的抗风湿药，具有突出的免疫抑制作用，常用于治疗人类RA。本研究以此典型的慢作用抗RA西药作为阳性对照药，对通痹灵的短期(治疗2周)与长期(治疗8周)疗效进行客观评价，结果表明：通痹灵短期治疗虽对控制关节炎症状无明显疗效，但已对CIA的免疫紊乱产生调节作用，如降低血清IgG型抗一CⅡ抗体滴度，以及IL-1β和TNF—α含量；病理学检查也发现滑膜炎症有所改善。通痹灵在高剂量时治疗8周对CIA具有明显的治疗作用，包括抗慢性关节炎症，抗软骨和骨破坏等作用，症状计分和放射线计分得以明显降低，这些表明通痹灵不仅能改善CIA的症状，而且还能改变CIA的病情。然而，通痹灵在低剂量时虽然能改善症状，但对关节骨质破坏无明显作用。MTX的短期疗效并不满意，但却能显著降低血清IgG2a型抗—CⅡ抗体滴度；长期治疗8周能明显改善症状和关节骨质破坏，降低血清IgG2a型抗—CⅡ抗体滴度。这一结果表 明MTX的对病情改善作用部分可能是通过抑制体液免疫应答实现的。 RA病理机制的关键在于关节的炎症，滑膜细胞增生，以及滑膜成纤维细胞在 持续释放的基质降解酶的介导下，粘附及侵入邻近的软骨及骨组织。控制RA和 CM关节骨质破坏的分子学基础尚未完全阐明。大量的资料表明关节的降解主要由 于侵袭性的滑膜衬里细胞，软骨细胞，渗透的炎症细胞等高表达MMPS所引起。 MMPS家族，特别是MMP2，刁和q在降解关节细胞外基质和软骨下骨的破坏中 发挥了重要作用。最近，这些蛋EI酶和他们的抑制因子己作为RA潜在的治疗靶点 而成为风湿病研究的主要焦点。 MMPS是锌依赖肽链内切酶家族，有24个成员，主要分四类，包括胶原酶， 明胶酶，基质溶素和膜型 MMPS。作为 MMPS中的一员，MMP上（基质溶素一 1） 对细胞外基质分子具有广泛的降解作用，因而被认为在关节炎中起着特别重要的 作用。几项研究表明 MMP刁直接导致了 RA的关节软骨基质降解。A4Nl，呕门2 kDa， 明胶酶 A）和 rvv习仪 rca，明胶酶 s）在 ＂uns家族中是独一无二的，因为他们 能裂解所有类型的变性胶原，天然的IV和V型胶原，弹性蛋白和其它基质蛋白。 在RA患者中MMPS表达升高已屡见报道，同健康人或是关节退行性变的病人相 比，RA患者的滑膜组织，滑膜液，以及血中，几种MMPS的水平明显升高。在 M及关节炎动物模型的软骨侵蚀处也观察到MMPS的高表达。已有研究发现CIA 小鼠关节软骨和滑膜中MMPs水平明显升高，可能是CIA关节破坏的主要因素。 为进一步探讨通痹灵抗关节破坏的分子作用机理，本研究首次开发了高敏竟 争定量RT—PCR检测系统。竞争PCR通过采用一个外源性竟争模板可以对靶基因 进行精确的定量。一个同源的竞。争子片段常被设计成同靶基因具有部分相同的序 列，可以被相同的引物对所识别。这一外源性的DNA或是RNA竞争子作为PCR 反应的内标。在竞争PCR中，内标和靶序列竟争同一引物序列，所以扩增是以竟 争的形式进行。把一定量（未知）的靶CDNA和系列稀释的竟争子DNA共同扩增， 其产物通过凝胶电泳进行分离与定量。如果靶基因与竟争子的扩增效率相同，那 么靶基因与竞争子PCR产物量的比值应该与他们在未进行PCR时的cDNAs的比 值相同。因为加入到每一扩增管中的竞争子的浓度在反应起始时可以精确定量， 所以不同样本中的靶cDNA的起始浓度也可以容易地计算出来。