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麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠影响的实验研究

夏鑫华  
【摘要】: 脑卒中是当今世界上最重要的致死性疾病之一,中国人群脑卒中发病率、死亡率在总死亡中所占比例,城市为20%,农村为19%。而在脑卒中中,缺血性中风占80%以上。临床上处理脑缺血性损伤的原则是尽早恢复血液再灌注,然而近年来发现,恢复缺血区的血供后,在一定程度上反而更加重了缺血性脑损伤,使脑细胞死亡数量进一步增加,加重病情,这种血流再通后引起的继发性损伤称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury CIRI),脑缺血再灌注损伤的存在使脑组织的功能障碍和结构损伤更严重,死亡率更高,大大降低了治疗效果,引起世人的广泛关注,成为近年来脑缺血研究的一个热点。 脑缺血再灌注损伤是一复杂的病理生理过程,其具体机制目前尚不完全清楚。近年来的研究发现,脑血流中断和再灌注使脑的细胞产生损伤是一个快速的级联反应,这个级联反应包括许多环节,如能量障碍、氧自由基的大量释放、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果,彼此重叠,并相互联系,形成恶性循环,最终导致细胞凋亡或坏死。 血循环重建后的再灌注性脑损伤日益增多,但目前还没有理想的治疗脑缺血再灌注损伤的药物。导师彭胜权教授根据长期的临床实践,认为脑为元神之府,清窍之所在,脑主神明,临床脑卒中的患者的病机主要是清窍闭阻,气血逆乱,故提出脑卒中的早期治疗应以芳香开窍为主,用药时可以麝香、冰片为主,再结合患者个体差异,辨证论治。麝香可“通诸窍之不利,开经络之壅遏”,是治疗脑病和其它危重疾病的常用药物。冰片亦是开窍醒神的常用药,多用于中风,痰热,神昏窍闭等症,常作辅药或引经药用,与麝香同用,可加强其疗效。 基于以往临床与实验研究的成果,本课题从实验研究角度从整体和分子水平全面去探讨麝香配伍冰片抗脑缺血再灌注损伤的机制。拓宽中药防治脑缺血再灌注损伤的思路,为提高中药的临床疗效提供科学依据。 1麝冰合剂抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的疗效观察 1.1局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的复制与评价 目的:复制SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,并评价效果。方法:通进改良线栓法建立中动脉脑缺血再灌注模型,并对模型进行早期行为学及组织学观察评价。结果:大鼠表现为不同程度的局灶性神经功能障碍,肉眼观察缺血侧大脑组织肿胀明显,光镜下观察脑神经细胞多数神经细胞核固缩,细胞外空隙明显增宽,间质疏松,显示细胞周围及间质水肿。结论:成功复制了MCAO模型。 1.2麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学及脑梗死体积影响的实验研究 目的:研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学及脑梗死体积的影响。方法:TTC染色法检测脑梗死体积,并比较其神经功能行为积分。结果:脑缺血2h再灌注24h,模型组脑梗死体积显著增大,与假手术组比较有统计学意义(P<0.01),神经功能行为积分显著升高(P<0.01);麝香配伍冰片组脑梗死体积较模型组缩小(P<0.01),同时,麝香冰片组、麝香组大鼠神经功能行为积分下降(P<0.05)。其中以麝香配伍冰片组作用最明显。结论麝香配伍冰片可减少局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积,改善脑缺血后神经行为症状。 1.3麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障通透性的影响 目的:研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)通透性的影响。方法:干湿重法观察脑含水量的变化,通过收集透出脑血管外的伊文思蓝(Evans Blue,EB)来示踪BBB的变化。结果:脑缺血2h再灌注24h,模型组较假手术组脑含水量及EB含量明显增加(P<0.01),血脑屏障遭到破坏;麝香配伍冰片组脑含水量较模型组明显降低(P<0.05),麝香配伍冰片组及冰片组EB含量较模型组明显降低(P<0.01)。结论:麝香配伍冰片可有效降低脑缺血再灌注后脑含水量及血脑屏障的通透性,对血脑屏障结构有一定的保护作用。 1.4麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元超微结构影响的实验研究 目的:研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元及突触超微结构的影响。方法:运用透射电镜观察大脑顶叶皮质神经元超微结构及突触的变化。结果:脑缺血2h再灌注24h,大脑皮层神经元的超微结构形态损坏明显,可见神经细胞缩小,线粒体肿胀,粗面内质网扩张等病变。麝香配伍冰片对大脑皮层神经元有不同程度的保护或修复作用。模型组较假手术组神经毡内突触明显减少(P<0.01),典型的突触结构遭到破坏;麝香配伍冰片组突触数量较模型组明显增多(P<0.05),突触形态大部分接近正常。结论:麝香配伍冰片可有效防止脑缺血再灌注导致的皮质内突触数量的减少,对神经元及神经元突触超微结构有一定的保护作用。 2麝冰合剂抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的分子机制研究 2.1麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠AQP-4 mRNA表达影响的研究 目的:研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织AQP-4 mRNA表达的影响。方法:应用实时荧光定量PCR技术,通过制备TaqMan探针进行测定。结果:与假手术组比较,模型组缺血侧脑组织AQP-4 mRNA表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较,麝香配伍冰片组、冰片组、缺血侧脑组织AQP-4 mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论:麝香配伍冰片组和冰片组可明显抑制AQP-4 mRNA的表达。 2.2麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠ICAM-1 mRNA表达影响的实验研究 目的:研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织ICAM-1 mRNA表达的影响。方法:应用实时荧光定量PCR技术,通过制备TaqMan探针进行测定。结果:与假手术组比较,模型组缺血侧脑组织ICAM-1 mRNA表达量明显增加(P<0.01)。与模型组比较,各组缺血侧脑组织ICAM-1 mRNA表达均明显降低(P<0.05~0.01),其中麝香冰片组下降最明显(P<0.01)。结论:麝香配伍冰片可抑制脑缺血再灌注后ICAM-1的表达,从而抑制脑缺血再灌注时白细胞与内皮细胞间的粘附,减轻缺血性脑损伤。 3本课题的特色和创新性 麝香及冰片单味药的基础和临床研究国内外都有着较丰富的资料,但是使用动物实验从整体和分子水平全面系统评价这一药对抗脑缺血再灌注损伤的作用尚属首次。在模型方面我们采用了与临床病人发病情况相类似的SD大鼠MCAO局灶性脑缺血再灌注模型,运用早期行为学及组织学观察评价,通过改良线栓法成功复制了此模型,稳定性、重复性较好。在国内外之前的有关脑缺血再灌注损伤研究中,AQP-4与ICAM-1的传统的检测方法均为RT-PCR方法或免疫组化法,我们首次运用了实时荧光定量PCR检测方法,通过制备AQP-4与ICAM-1基因的TaqMan探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织脑水肿相关基因AQP-4 mRNA与炎症反应相关基因ICAM-1 mRNA表达的影响,提高了实验的准确度及可信性。


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