收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

芦荟多糖干预的PBMC对肝癌细胞的作用及其机制研究

苗艳艳  
【摘要】: 本课题在较全面综述近年来芦荟研究进展及肝癌中西医综合治疗研究的基础上,重点开展了芦荟多糖干预的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)对肝癌细胞生长的作用及其机制的实验研究。文献研究表明,芦荟多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、保肝、降血糖、促进创伤和溃疡愈合及抗炎、抗病毒等多方面的药理活性。其中,芦荟多糖的抗肿瘤作用是我国近年芦荟研究的热点之一,但已有的研究多为动物实验研究,研究成果多数尚待临床研究证实。本课题通过研究芦荟多糖AP11干预的PBMC对肝癌细胞生长的作用,从细胞水平探讨了芦荟多糖的抗肿瘤作用机制。 目的: 通过研究芦荟多糖AP11干预的PBMC对肝癌细胞生长的作用,探讨芦荟多糖的抗肿瘤作用机制。 方法: 1、采用水提醇沉法提取芦荟粗多糖,无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,三氯乙酸除蛋白,得精制芦荟粗多糖AP1,选用10万分子量与3万分子量的超滤膜截留不同分子量芦荟多糖AP11(分子量>10万)、AP12(3万<分子量<10万)、AP13(分子量<3万),蒽酮-浓硫酸法测定各多糖含量,考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。 2、采用人淋巴细胞分离液、Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离PBMC。AlamarBlue法测定不同浓度芦荟多糖AP11、AP12、AP13对PBMC生长的影响,MTT法测定不同浓度芦荟多糖AP11、AP12、AP13对HepG2生长的影响。 3、Alamar Blue法测定芦荟多糖AP11单独及联合Anti-CD3McAb、rhIL-2对PBMC生长的影响。MTT法测定多糖AP11干预后PBMC上清及PBMC细胞悬液对HepG2生长的影响。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多糖AP11对PBMC各组上清中IFN-γ、TNF-α水平的影响,流式细胞仪检测其FasL的表达。ELISA法测定干预后各组PBMC对HepG2上清中IFN-γ、TNF-α水平的影响,AKP检测试剂盒测定对AKP水平的影响,流式细胞仪检测干预后HepG2细胞周期、凋亡率及其Fas的表达。 4、以手术切除肝癌组织为标本,胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养法原代培养肝癌细胞,通过倒置显微镜观察其形态学特征。并于分离培养的第2天,加芦荟多糖AP11、芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC于癌细胞中,倒置显微镜观察其对癌细胞形态的影响。MTT法测定其对癌细胞生长的影响。 结果: 1、从库拉索芦荟凝胶冻干粉中提取的芦荟多糖AP1、AP11、AP12、AP13中多糖所占比例分别为58%、79%、84%和85%;蛋白含量分别为15.61μg/mL、13.33μg/mL、21.03μg/mL和10.70μg/mL。 2、人淋巴细胞分离液、密度梯度离心法可成功分离PBMC,细胞的存活率可达95%以上。不同分子量芦荟多糖对PBMC的生长有一定的促进作用。与PBMC空白对照组相比,AP11(200μg/mL)组可显著促进PBMC生长(P<0.01)。与空白对照HepG2组相比,各浓度AP11、AP12、AP13组对HepG2生长的影响没有明显差异(P>0.05)。 3、与空白对照PBMC组(BC组)相比,芦荟多糖AP11及其联合Anti-CD3McAb、rhIL-2对PBMC的生长有不同程度地促进作用。与空白对照HepG2组(H组)相比,干预后各组PBMC效应细胞的上清液对HepG2生长的影响无明显差异(P>0.05),干预后各组PBMC效应细胞可不同程度抑制HepG2的生长。 光镜下观察可见,H组细胞以多边形细胞为主,细胞核异型性明显,核仁清晰,核大,胞浆透明。与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组CIAP+H组细胞镜下生长视野减少,均出现不同程度的形态改变,大多细胞呈梭形、蝌蚪形,部分细胞皱缩,变黑、变圆。 芦荟多糖AP11对PBMC上清中IFN-γ水平的影响:与BC组相比,CI组和CIAP组的IFN-γ水平显著提高(P<0.01);与AP组比,CI组和CIAP组的IFN-γ水平显著提高(P<0.01),与BC组相比差异显著(P<0.01)。 芦荟多糖AP11对PBMC上清中TNF-α水平的影响:BC组、AP组、CI组和CIAP组之间的TNF-α水平无明显变化(P>0.05)。 效应细胞对靶细胞HepG2上清中IFN-γ水平的影响:与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组与CIAP+H组IFN-γ水平显著提高(P<0.01);与BC+H组相比,AP+H组、CI+H组与CIAP+H组IFN-γ水平显著提高(P<0.01)。 效应细胞对靶细胞HepG2上清中TNF-α水平的影响:与H组相比,BC+H组有增高的趋势,AP+H组、CI+H组与CIAP+H组TNF-α水平显著提高(P<0.01);与BC+H组比,AP+H组TNF-α水平有明显提高(P<0.05),CI+H组与CIAP+H组TNF-α水平显著提高(P<0.01)。 流式细胞仪检测结果显示,H组细胞在正常二倍体细胞DNA峰(G1峰)前无明显的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率很低(5.13%),更多处于S期(43.33%),较少处于G1期(52.27%);与H组相比,CIAP+H组中靶细胞在G1峰前出现明显的凋亡峰,凋亡率显著增高(30.37%,P<0.01),S期比例降低(24.37%,P<0.05),较多处于G1期(75.63%,P<0.05)。与H组相比,其余各组靶细胞都有凋亡峰出现,其凋亡率、S期比例都有不同程度降低,G1期比例有不同程度增加。 芦荟多糖AP11对PBMC FasL表达的影响:与BC组相比,AP组、CI组和CIAP组的FasL荧光表达率升高。 效应细胞对HepG2 Fas表达的影响:与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组与CIAP+H组的Fas荧光表达率升高。 4、胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞。培养6h后即可在倒置显微镜下观察到贴壁细胞,48h可观察到细胞呈单个或团块状贴壁生长,每个团块约有20~100个不等的细胞,有的细胞已经完全贴壁展开。倒置显微镜下,活细胞以多边形或不规则上皮样细胞为主,有少量梭形细胞。细胞核异型性明显,核仁清晰,核大,胞质少,胞浆内可见丰富颗粒及空泡。与未加多糖干预的空白对照组相比,癌细胞在数量及形态上没有明显的变化。与未加PBMC干预的癌细胞相比,芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC作用于癌细胞后,癌细胞形态发生明显变化,细胞混合后6h,一部分细胞形态由多边形变为梭形,一部分细胞皱缩,变黑、变圆。MTT实验结果表明,与癌细胞空白对照组比,芦荟多糖AP11对原代肝癌细胞生长的影响没有明显差异(P>0.05);芦荟多糖AP11干预及未干预PBMC组可明显抑制肝癌细胞的生长(P<0.01)。 结论: 1、在传统多糖提取工艺的基础上,得到纯度较高的不同分子量芦荟多糖AP11、AP12、AP13,为本研究提供了理想的实验用药。 2、成功建立PBMC分离方法。PBMC体外分离后第1天,其数量有下降趋势,第4~6天比较稳定,我们选用处于稳定期的细胞作为实验用细胞模型。PBMC的活性与供血者体质及体外培养条件有关。芦荟多糖AP11(200μg/mL)组可显著促进PBMC生长。不同分子量的芦荟多糖对HepG2的生长没有明显抑制作用。 3、芦荟多糖AP11单独及其联合Anti-CD3McAb与rhIL-2应用可显著促进体外PBMC的增值,同时可增加PBMC IFN-γ的分泌,增强FasL的表达。表明其可以促进PBMC的增殖,并能增强其分泌杀伤肿瘤活性细胞因子IFN-γ的分泌,提示其抗肿瘤作用与增强机体免疫,诱导细胞凋亡有关。 芦荟多糖AP11干预的PBMC效应细胞上清液对HepG2的生长没有明显抑制,而PBMC效应细胞可以显著抑制HepG2的生长,并能诱导HepG2靶细胞的凋亡、改变其细胞周期。此外,还能增加混合培养后细胞上清中IFN-γ、TNF-α的水平,降低AKP的水平及增强靶细胞Fas蛋白的表达。提示芦荟多糖AP11的抗肿瘤作用与降低肿瘤细胞活性、改变细胞周期、提高IFN-γ和TNF-α水平,通过IFN-γ与TNF-α的协同作用及激活Fas/FasL途径、诱导凋亡有关。 4、胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞。其活性与肝癌患者发病阶段及体外培养条件有关。芦荟多糖对原代培养肝癌细胞的生长及形态没有明显作用。芦荟多糖干预及未干预的自体PBMC对原代肝癌细胞有明显的抑制作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 谷平;;美容美食数芦荟[J];健身科学;2011年08期
2 樊嘉;;导言:原发性肝癌的治疗策略[J];医学与哲学(临床决策论坛版);2011年06期
3 刘扬;周波;宋振顺;;治疗原发性肝癌的专家共识[J];家庭医学;2011年06期
4 公建庄;;原发性肝癌并右肩部软组织转移1例[J];胃肠病学和肝病学杂志;2011年06期
5 白冬梅;;温阳涤浊法治疗原发性肝癌浅析[J];中国社区医师(医学专业);2011年23期
6 宋文军;彭顺清;周志勇;黄彬彬;伍志新;周丽华;;三维适形放疗联合肝动脉栓塞化疗治疗原发性肝癌的研究[J];医学信息(上旬刊);2011年09期
7 申丽盈;王文红;勾威;邹庆华;;索拉非尼联合恩度治疗原发性肝癌11例临床观察[J];吉林大学学报(医学版);2011年04期
8 罗晓勇;胡立宏;张凤祥;;三维适形放疗治疗原发性肝癌26例疗效观察[J];中国医药指南;2011年16期
9 赵永强;折占飞;;原发性肝癌基因治疗进展[J];疾病监测与控制;2011年08期
10 何军强;苏兴桂;;手术切除原发性肝癌42例疗效分析[J];中华普通外科学文献(电子版);2011年04期
11 吕定丰;;原发性肝癌患者血清乙肝病毒感染情况临床观察[J];现代实用医学;2011年05期
12 蔡佳;;原发性肝癌肝外表现42例临床分析[J];现代医药卫生;2011年14期
13 吴淑媛;罗惠林;曹海鹰;陈奕明;梁宇;冉江华;;原发性肝癌的外科综合治疗体会——附72例报道[J];中国医药指南;2011年18期
14 金少纯;;原发性肝癌血管介入治疗65例的临床研究[J];中外医疗;2011年19期
15 洪淑英;;三维适形放疗联合肝动脉化疗栓塞治疗原发性肝癌的疗效[J];实用癌症杂志;2011年04期
16 窦云;;原发性肝癌合并肝肾综合征、低血糖1例临床报道[J];亚太传统医药;2011年08期
17 郭俊;邬雨春;王海江;石宝琪;钱海龙;;消癌平注射液辅助介入治疗原发性肝癌疗效观察[J];包头医学院学报;2011年03期
18 周志红;;原发性肝癌介入治疗的护理[J];当代护士(专科版);2011年S1期
19 杨辉;李鹤平;张冰;杨建勇;刘锦召;许卫国;;沙培林碘化油乳剂治疗原发性肝癌的中远期疗效分析[J];当代医学;2011年14期
20 董顺红;;原发性肝癌自发性破裂出血病人的护理[J];全科护理;2011年19期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李惠;刘付玉荣;;原发性肝癌手术治疗142例护理体会[A];中华护理学会2009全国外科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2009年
2 吴春燕;郭晓钟;崔忠敏;李宏宇;赵佳钧;王迪;任丽楠;;AFU、AFP、GGT、ALP和AST联合诊断原发性肝癌[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
3 邵梦扬;杨学峰;;癥积消胶囊治疗原发性肝癌的临床研究[A];第八届全国中西医结合肿瘤学术会议论文集[C];2000年
4 王洪;张波;;乙型肝炎后肝硬化患者并发肝癌的危险因素研究[A];第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议论文汇编[C];2006年
5 罗小平;;原发性肝癌动-静脉瘘的介入治疗及临床价值:附38例报告[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编(上册)[C];2006年
6 陈耀庭;许林锋;任强;马海清;张靖;周经兴;骆江红;陆佩霞;谭绮云;;CT引导经皮微波凝固肝动脉化疗栓塞后原发性肝癌的临床应用[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编(下册)[C];2006年
7 彭志英;黄亨建;郭丹;李一松;吕瑞雪;安振梅;;Cystatin C在原发性肝癌组织中表达的初步研究[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
8 耿坚;姚明荣;詹松华;王辉;;中药辨证介入治疗原发性肝癌近期疗效观察[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年
9 范卫君;张亮;欧阳育树;王立刚;;磁共振扩散加权成像评价原发性肝癌经导管动脉化疗栓塞术疗效的随访研究[A];中国(第七届)肿瘤微创治疗学术大会暨世界影像导引下肿瘤微创治疗学会成立筹备大会论文汇编[C];2011年
10 包剑锋;;原发性肝癌的中医药治疗进展[A];浙江省中医药学会肝病专业委员会2009年学术年会暨肝病新进展继续教育学习班论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 苗艳艳;芦荟多糖干预的PBMC对肝癌细胞的作用及其机制研究[D];广州中医药大学;2008年
2 卢彦达;原发性肝癌三维适形放疗乙型肝炎病毒再激活[D];天津医科大学;2010年
3 高姗;上海市区原发性肝癌的流行病学研究[D];复旦大学;2011年
4 文洁;终末期肝病模型与原发性肝癌患者肝脏储备功能及中医证候的相关性研究[D];第二军医大学;2010年
5 梁嵘;高尔基体糖蛋白73对原发性肝癌的诊断价值研究[D];广西医科大学;2012年
6 田丽媛;原发性肝癌实验检测及相关辅助诊断技术研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
7 王娜;江苏省海门市原发性肝癌时间趋势及相关危险因素队列研究[D];复旦大学;2010年
8 李玉春;MicroRNA相关单核苷酸多态性与原发性肝癌遗传易感性研究[D];郑州大学;2012年
9 胡劲松;血清GP73对原发性肝癌诊断的实验研究[D];中南大学;2010年
10 李婷;人腹膜间皮细胞的原代培养与鉴定卵巢癌细胞腹膜侵袭与转移机制的研究[D];山东大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 于里涵;原发性肝癌肿瘤位置对手术切除的影响及手术方式的临床分析[D];吉林大学;2011年
2 吴凡;巨大原发性肝癌的外科治疗[D];北京协和医学院;2011年
3 徐海燕;原发性肝癌自发性破裂出血治疗分析[D];中南大学;2010年
4 李业飞;大体肿瘤体积评估原发性肝癌放射治疗预后的价值[D];广西医科大学;2011年
5 丁海;基质金属蛋白酶-2和抑癌基因nm23在原发性肝癌中的表达及其临床意义[D];苏州大学;2001年
6 吴凤萍;原发性肝癌患者的耳穴规律探讨[D];广州中医药大学;2010年
7 何颖;177例40岁以下原发性肝癌合并乙肝肝硬化患者临床分析[D];广西医科大学;2011年
8 郑翔;原发性肝癌中IL-17的表达及意义的研究[D];华中科技大学;2010年
9 李清春;(125)~I放射性粒子植入术治疗原发性肝癌的临床研究[D];吉林大学;2011年
10 赵翔宇;射频消融治疗原发性肝癌的临床应用研究[D];昆明医学院;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 驻京记者 王丹;《原发性肝癌规范化诊治专家共识》发布[N];医药经济报;2009年
2 胡继雄;隐匿杀手原发性肝癌[N];大众卫生报;2003年
3 冯大夫;原发性肝癌的特点及诊治[N];人民日报海外版;2000年
4 日升;拜耳支持原发性肝癌规范化诊疗推广项目[N];中国医药报;2010年
5 蒲昭和;芦荟多糖具有抗肿瘤作用[N];中国医药报;2001年
6 中南大学湘雅医院急诊科 教授 罗学宏;以肝破裂为首发症状的原发性肝癌[N];医药经济报;2009年
7 王建中;中医对原发性肝癌的认识与治疗[N];中国中医药报;2004年
8 忠文;治原发性肝癌验方[N];民族医药报;2001年
9 市第三人民医院肝胆外科主任医师 李宏欣;原发性肝癌的微波原位灭活治疗[N];镇江日报;2008年
10 曾运红 谭卫仙;原发性肝癌的主要危险因素[N];中国中医药报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978