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寿胎丸的药物组成及其补肾安胎的药效学研究

郜洁  
【摘要】: 目的: 本研究以临床药效确切的补肾安胎复方寿胎丸为研究对象,以肾虚-黄体抑制大鼠流产模型(病-证结合模型)为研究载体,以流产率、雌二醇(E_2)、孕激素(P)、孕激素受体(PR)的表达为评价追踪指标,对寿胎丸进行提取方法的筛选,并通过均匀设计对寿胎丸进行复方组成及配伍规律的研究,经药效验证筛选出补肾安胎的优选配比方,总结并验证了肾虚-黄体抑制大鼠流产造模的标准流程,初步建立了寿胎丸补肾安胎的药效学评价体系。 方法: 实验一: 购置组成复方的各道地药材,并进行生药鉴定。在前期研究基础结合文献研究,确定复方寿胎丸溶液的不同提取方法并制备成为寿胎丸水提液(A药液)、乙醇提取液(B药液)、醇提后药渣水提液(C药液)、醇提+醇提后药渣水提液(B+C药液)。妊娠第1日至第9日以450mg/kg/d羟基脲灌胃,第10天时予以米非司酮(RU486)4.0mg/kg建立肾虚自然流产模型。将70只SPF级SD孕鼠随机分为7个组:①正常对照组;②模型组对照组(羟基脲+米非司酮);③阳性对照组(羟基脲+米非司酮+地屈孕酮,简称阳性组);④寿胎丸A组(羟基脲+米非司酮+寿胎丸水提液);⑤寿胎丸B组(羟基脲+米非司酮+乙醇提液);⑥寿胎丸C组(羟基脲+米非司酮+寿胎丸乙醇提取后药渣水提液);⑦寿胎丸B+C组(羟基脲+米非司酮+寿胎丸乙醇提取液与醇提后药渣水提液的混合液)。 24小时后无菌低温条件下处死大鼠,取子宫经滤纸吸干、称重、计算胚胎数、流产率、测量胚胎直径。用电化学发光法测定血清E_2、P水平。无菌低温条件下取出同侧大鼠子宫新鲜的蜕膜组织,30分钟内采用qRT-PCR方法检测蜕膜组织PR mRNA的表达。 实验二: 通过均匀设计得到8个不同剂量配比的寿胎丸组方,将110只SPF级SD孕鼠随机分为11个组:正常对照组(简称对照组)、模型组对照组(羟基脲+米非司酮)、阳性对照组(羟基脲+米非司酮+地屈孕酮,简称阳性组)、8个不同配比的寿胎丸用药组。造模方法、检测方法同实验一。 分别进行多元回归分析、典型相关分析、直接最优化分析、综合加权分析,并结合均匀设计软件预报设计及临床用药经验,筛选出理论优选方。 实验三: 在实验二得出的理论优选方的基础上,将60只SPF级SD孕鼠随机分为6个组:①模型组对照组(羟基脲+米非司酮);②阳性对照组(羟基脲+米非司酮+地屈孕酮,简称阳性组);③寿胎丸临床常用量组(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=20:10:10:5);④寿胎丸优选1号方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=15:21:21:0);⑤寿胎丸优选2号方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=20:10:10:0);⑥寿胎丸优选3号方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=30:21:21:5)。 造模方法与检测方法同实验一。经统计分析得出剂量配比优选方。 结果: 建立肾虚-黄体抑制大鼠流产模型的标准流程,孕鼠表现出中医肾虚证侯、脏器指数下降,流产率升高,分泌E_2、P水平降低,PRmRNA表达下调。经寿胎丸治疗后能够改善上述流产状态,抑制流产率、增加E_2、P水平,上调PRmRNA表达,来实现保护胚胎的作用。 实验一: 1寿胎丸A组、B组、C组和(B+C)组大鼠的体重、饮食量、卵巢指数、连胎子宫指数与模型组比较,差异无显著性(P>0.05)。 2在流产率方面,寿胎丸A组、B组、C组和(B+C)组大鼠的流产率与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。A组、B组、C组、B+C组大鼠的流产率与阳性对照组比较差异无显著性(P>0.05)。A组、B组、C组、B+C组大鼠的流产率各组间比较,差异无显著性(P>0.05)。 3在雌激素水平方面,寿胎丸A组、B组、C组和B+C组大鼠的雌二醇水平与模型组比较,差异无显著性(P>0.05)。 4在孕激素水平方面,寿胎丸A组、B组、C组大鼠的孕激素水平与模型组比较,差异无显著性(P>0.05)。B+C组大鼠的孕激素水平与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。A组、B组、C组、B+C组大鼠的孕激素水平与阳性对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。 5在孕激素受体表达方面,寿胎丸A组、C组大鼠的孕激素受体的表达与模型组比较,差异无显著性(P>0.05)。寿胎丸B组、B+C组大鼠孕激素受体的表达与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。B组大鼠的孕激素受体的表达与B+C组比较,差异无显著性(P>0.05)。 6通过等值加权综合计算各指标与模型组的相对百分率,在寿胎丸各个提取方法中,B+C组与模型组的相对百分率最高,推测B+C组防治流产的作用最强。 7综合各指标进行多元方差分析时,4个指标平衡等值加权处理后比较,差异有显著性(P<0.05),在降低流产率方面,B+C组>B组>C组>A组;在提高E_2水平方面,B+C组>A组>C组>B组;在提高P水平方面,B+C组>A组>C组>B组;在上调PR表达方面,B+C组>B组>A组>C组。综上B+C组防治流产的作用最强。与寿胎丸各提取部位与模型组的相对百分率的推断一致。 实验二、三: 1模型组大鼠的连胎子宫指数与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。阳性组、组二、组四、组五、组六组大鼠的连胎子宫指数与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。 2模型组大鼠的流产率与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。阳性组、组一、组二、组三、组四、组五、组六、组七和组八大鼠的流产率与模型组比较,差异有显著性(P<0.01)。 3模型组大鼠血清中雌激素水平与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。阳性组、组一、组二、组三的大鼠血清中雌激素水平与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。 4模型组大鼠血清中孕激素水平与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。阳性组、组一、组二、组三、组四、组六大鼠血清中孕激素水平与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。 5模型组大鼠子宫蜕膜中孕激素受体表达与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。组一、组二、组三、组四、组五、组六子宫蜕膜中孕激素受体与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。 6寿胎丸组成药物的关系: 6.1各单味药的补肾安胎贡献度的定性分析:菟丝子>桑寄生=续断>阿胶。 6.2交互作用中:菟丝子与桑寄生、菟丝子与阿胶的交互作用与流产率有相关性;菟丝子与桑寄生、桑寄生与续断的交互作用与E_2有相关性;菟丝子与桑寄生、菟丝子与阿胶、桑寄生与续断、桑寄生与阿胶、续断与阿胶的交互作用与P有相关性;菟丝子与桑寄生、菟丝子与阿胶、桑寄生与续断交互作用与PR有相关性。 7将药效学指标与不同剂量配比的寿胎丸相关联,经二次回归得到的回归方程为(R~2=0.9832,P<0.05):(?)=35.0123-0.2204*X1*X3-0.02321*X1*X4+0.2165X2X3+0.01078*X1~2得到理论优选寿胎丸方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=15:21:21:0)。 8由验证实验得出,寿胎丸优选1号方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=15:21:21:0)、寿胎丸优选2号方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=20:10:10:0)、寿胎丸常量方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=20:10:10:5)与模型组比较,差异有显著性(P<0.05)。但组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1罗颂平教授创立的肾虚-黄体抑制(病证结合)流产模型,成功模拟了临床上肾虚型自然流产的状态。本研究在总结前期研究的基础上,初步制定肾虚-黄体抑制(病证结合)流产模型的SOP。 2初步确立了寿胎丸的提取流程,并通过药效学实验筛选得到经醇提+醇提后水提的寿胎丸对肾虚流产大鼠模型的补肾安胎药效最优。 3验证了寿胎丸可明显降低流产率,寿胎丸具有拮抗米非司酮,促进妊娠黄体和合体滋养细胞分泌功能,提高血清E_2、P水平,通过增加孕激素受体mRNA的转录来上调PR的表达,通过改善孕鼠的肾虚状态来实现保护胚胎的作用。 4寿胎丸组成的药物关系:①各单味药的贡献度的定性分析:菟丝子>桑寄生=续断>阿胶;②交互作用的定性分析:菟丝子与桑寄生交互作用与各个指标均有相关性;桑寄生与续断的交互作用与E_2、P、PR有相关性;菟丝子与阿胶的交互作用与流产率、P、PR有相关性;续断与阿胶的交互作用与P有相关性。③定性研究初步证明了寿胎丸配伍关系,菟丝子与桑寄生交互作用(君臣关系)>桑寄生与续断的交互作用(臣佐关系)>续断与阿胶的交互作用(佐使关系);菟丝子与桑寄生交互作用(君臣关系)>菟丝子与阿胶的交互作用(君使关系)>续断与阿胶的交互作用(佐使关系),与原方的配伍关系基本一致。 5验证了阿胶在原方中处于使药的地位,起调和药性的作用,在本实验研究中阿胶的补肾安胎作用不显著。 6将药效学指标与不同剂量配比的寿胎丸相关联,经二次回归得到的回归方程为(R~2=0.9832,P<0.05):(?)=35.0123-0.2204*X1*X3-0.02321*X1*X4++0.2165X2X3+0.01078*X1~2 经最优分析得出理论优选寿胎丸方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=15:21:21:0)。 7经过药效验证实验,寿胎丸优选1号方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=15:21:21:0)、寿胎丸优选2号方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=20:10:10:0)与寿胎丸常量方(菟丝子:桑寄生:续断:阿胶=20:10:10:5)均具有较好的补肾安胎作用,与阳性对照药物抑制流产作用相当。寿胎丸优选2号方>阳性对照药物>寿胎丸优选1号方>常量方,均可以保护胚胎、降低流产率。 8本研究初步建立了系统的寿胎丸补肾安胎作用的药效学评价体系,规范改良了造模方法、筛选了药效评价的指标,运用数学方法与计算机技术相结合研究复方组方关系和优选配比,并审慎地分析了实验结果,为寿胎丸深层次的配伍规律及药效物质基础研究奠定了基础。


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