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足叶乙苷长循环脂质体制备及抑瘤性研究

时军  
【摘要】: 癌症,是严重威胁人类健康的疑难疾病之一。由于其早期确诊和发现的困难,相当数量的癌症病人必须依赖化学治疗,因此进行抗癌药物的研究非常重要。自从1946年氮芥用于治疗恶性淋巴瘤以来,抗癌药物研究已得到飞速发展,并且日益受到临床上的重视。抗癌药物在肿瘤治疗、延长肿瘤患者生命和提高生活质量方面,具有重要的意义和作用。但是,这些化疗药物缺乏特异性,作用于癌细胞的同时也损伤了正常细胞,毒副作用不可轻视,如骨髓抑制、胃肠道反应等。 脂质体具有良好的生理相容性,可赋予药物良好的靶向性能,改变药物分布规律,提高药物的疗效和治疗指数,是抗肿瘤药物的理想传输载体。然而普通脂质体易于渗漏,血浆中内源性物质易对其造成破坏,存在稳定性差、在血液中半衰期较短等问题,限制了脂质体的开发和应用。近年来的研究发现,将脂质体表面进行亲水基团修饰,可改善脂质体的稳定性,改变脂质体的体内命运。脂质体表面聚乙二醇修饰通常称为长循环脂质体,能够降低巨噬细胞系统(MPS)和血浆中的成分对脂质膜的破坏,明显延长药物在体内的循环时间,增加药物在肿瘤新生血管的渗漏,具有促进药物在肿瘤组织渗透和滞留效应,研究和应用受到越来越多的重视。 足叶乙苷,中药鬼臼有效成分鬼臼毒素的衍生物,通过抑制哺乳类动物DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性发挥抗肿瘤效应,具有广谱抗癌活性,是目前临床上应用广泛的一线抗癌药。主要用于治疗小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、白血病,对神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌和食管癌等也有一定疗效。目前,市场上已有注射剂和软胶囊剂型,由于药物存在水溶性差、生物利用度不高,临床应用时毒副作用明显,病人的顺应性较差。 本课题研究设计的长循环脂质体制剂,在脂质体表面进行PEG修饰,形成致密的构象云和厚的立体位阻层,一方面增加脂质体的溶剂化作用,另一方面有效阻止脂质体表面的调理作用,降低MPS对脂质体的亲和力而减少了脂质体在血液循环中破坏,延长血液中的滞留时间。同时,形成的PEG极性长链类似一层保护膜,使脂质体微粒间具有稳定的Zeta电位,脂质体微粒不会融合、沉降,在血浆中长时间保持完整原型,易于通过通透性大的肿瘤新生血管,从而释放药物和实现肿瘤部位的靶向作用。因此,本课题设想通过长循环脂质体载体的包封,增加足叶乙苷药物的稳定性,延长药物在血液中的半衰期,降低毒副作用,提高药物的肿瘤部位靶向性能。 基于以上目的,本文主要进行以下几个方面的研究。 首先进行足叶乙苷处方前研究,包括建立足叶乙苷HPLC含量测定方法、油水分配系数和包封率测定方法。在此基础上,进行足叶乙苷长循环脂质体的处方设计和制备工艺研究,考察了磷脂材料、缓冲液介质、PEG修饰材料的用量、抗氧化剂以及脂质浓度后,确定处方;通过几种常见的脂质体制备方法筛选,以包封率和性状特征指标,最终确定采用乙醇注入法制备脂质体,并通过单因素优选和正交试验,优选最佳工艺条件。结果表明,乙醇注入法避免使用有毒有机溶剂,产品性能稳定,包封率、粒径大小适中并符合正态分布。 对足叶乙苷长循环脂质体的理化性质进行系统考察,主要包括粒径、形态学、Zeta电位、体外释放度、含量测定、包封率测定及稳定性考察等。结果表明,足叶乙苷长循环脂质体外观呈半透明略带乳光的悬液,色泽均匀,流动性好。通过透射电镜观察,脂质体微粒大小均匀,圆整,分散性好。脂质体样品的粒径分布范围较窄,平均粒径112nm,呈单峰分布;用凝胶柱分离法测定包封率,测定结果在80%以上;氧化指数低,化学稳定性考察结果表明氧化程度小;样品在pH7.4磷酸盐缓冲液和大鼠血浆中24h渗漏率分别为(38.27±3.15)和(46.72±2.20)%,说明足叶乙苷长循环脂质体物理稳定性良好;放样稳定性结果表明,足叶乙苷长循环脂质体在4℃条件下放置3月仍能保持稳定;稀释稳定性表明,将其按临床用法稀释,可以保持稳定,没有药物的渗漏和沉淀。 进一步观察足叶乙苷长循环脂质体的长循环特性,采用KM种小鼠进行药物代谢动力学和组织分布试验。在建立血浆和组织中药物测定方法的基础上,按一定的时间间隔目眦静脉采血,处理样品进行HPLC分析。结果表明,足叶乙苷长循环脂质体的t_(1/2,α)、t_(1/2,β)和AUC分别是普通注射液的10、17和3.5倍,普通脂质体的t_(1/2,α)、t_(1/2,β)和AUC分别是普通注射液的4、2.5和1.4倍。说明在相同剂量下,注射剂的分布和消除都比长循环脂质体快,长循环脂质体在体内能够维持较长循环时间。普通注射液的C1为长循环脂质体的3.5倍,长循环脂质体制剂体内消除较慢。组织分布测定结果表明,相对于足叶乙苷注射液和普通脂质体,足叶乙苷长循环脂质体在心脏、肝脏中的药物分布明显减少,在血浆中的分布明显增多。 对足叶乙苷长循环脂质体进行急性毒性试验,并用寇氏法计算LD_(50)值。测定结果表明,足叶乙苷注射液的LD_(50)值为86.6mg/kg,足叶乙苷长循环脂质体的LD_(50)值179.1 mg/kg,是注射液组的2倍多,说明足叶乙苷制成脂质体后,可以显著降低毒副作用,增加用药的安全性。 为预测足叶乙苷长循环脂质体的治疗效果,通过C_(57)BL/6J小鼠接种Lewis肺癌,建立肿瘤模型后给药,以16日的小鼠肿瘤重量为指标,进行抑瘤率考察。结果表明,足叶乙苷长循环脂质体组的抑瘤率为64.15%,明显高于足叶乙苷注射液组的47.92%、普通脂质体组的58.49%。肿瘤组织病理切片的结果显示,足叶乙苷长循环脂质体组的肿瘤组织出现明显的核凝固坏死现象,且肿瘤的肺转移不明显。 综上所述,本课题采用乙醇注入法制备了符合药典要求的、具有一定靶向性能的足叶乙苷长循环脂质体,制备工艺稳定,粒径、包封率、载药量和渗漏率等指标皆符合要求。该制剂不仅可以延长药物在体内的循环时间,并在肿瘤组织浓集,具有一定的抑瘤效果。


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