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猪苓及猪苓多糖对TLR介导的BCG抗大鼠膀胱癌的免疫调节机制研究

李彩霞  
【摘要】: 研究背景 卡介苗(BCG)灌注治疗浅表性膀胱癌是公认的首选疗法,但在灌注药物中BCG副作用严重。如何减少其副作用并能提高疗效的机制研究一直是研究的重点课题。猪苓广泛用于治疗肿瘤的辅助药物。猪苓多糖(PPS)是猪苓的主要成分,可通过对肿瘤细胞的直接作用和调节免疫功能而发挥作用。体外实验研究表明,PPS与BCG协同作用优于BCG的单独作用。TLRs作为天然免疫和获得性免疫的天然桥梁,是BCG及猪苓多糖抗肿瘤重要作用机制之一,但目前关于TLR的研究多局限于体外实验,在动物体内的复杂环境下猪苓、猪苓多糖和BCG能否通过此通路启动机体免疫反应并进一步调节免疫应答的类型尚未得到确认。 目的 本研究在原有体外实验基础上,利用大鼠膀胱癌模型,重点研究猪苓或猪苓多糖及BCG和BCG协同猪苓或猪苓多糖作用后,对机体免疫功能状态如淋巴细胞亚群百分率、巨噬细胞TLRs及相关分子的表达等的影响,从天然免疫到获得性免疫,探讨猪苓或猪苓多糖抗大鼠膀胱癌的免疫调节机制及猪苓或猪苓多糖增强TLR介导的BCG抗肿瘤作用机制,为研制减毒增效的中西医结合膀胱灌注药物提供理论依据和实验数据。同时,探讨猪苓多糖对膀胱癌T24细胞的直接作用过程中对PPARγ的表达及rHSP70对小鼠巨噬细胞的TLR4及NF-kB表达的影响。 方法 1膀胱癌动物模型的建立及分组;药物干预后第六周、第十二周眼眶后静脉丛采血,流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4+和CD8+、CD28+、CD25+及TCRγδ+表达变化。 2采集腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞吞噬率、TOLL样受体及相关免疫分子的表达;Griess法检测体外腹腔巨噬细胞NO的释放;体外培养小鼠巨噬细胞J774A.1,与小鼠rHSP70共培养24h、48h,流式细胞术检测J774A.1细胞TLR4的变化及免疫细胞化学检测NF-kB的表达; 3大鼠膀胱病理组织切片,中性福尔马林固定,石蜡包埋,5μm厚切片,常规HE染色;免疫组化SP法检测PPARγ、NF-kB、CD40、CD86膀胱肿瘤中的表达特征;RT-qPCR检测大鼠膀胱组织中PPARγ、TLR2、TLR4 mRNA相对含量。 4猪苓多糖对T24膀胱癌细胞直接作用过程对PPARγ的表达:48hRT-qPCR检测PPS及PPARγ拮抗剂BADGE分别和协同作用于T24细胞PPARγmRNA的表达,Westernblot及免疫细胞化学检测PPARγ定位及蛋白表达。 第一部分 结果 1模型组外周血CD3+、CD4+CD3+和CD8+CD3+、CD28+的T淋巴细胞的百分率(均值)均明显低于空白对照组;药物干预后第六周,PPS及不同剂量猪苓组CD8+CD3+和CD28+与模型组比较均显著升高(P0.05);第十二周后,PPS组CD4+CD3+的T淋巴细胞的百分率显著升高(P0.05),不同剂量猪苓组CD28+表达均升高,其中中剂量组升高显著(P0.05)。(P0.05)。PPS组TCRγδ+的T淋巴细胞的百分率(均值)同模型组显著升高(P0.05); 2 PPS组显著促进巨噬细胞吞噬率的增加,巨噬细胞表面共刺激分子CD86、CD40、TLR4/CD14的表达均显著升高不同浓度猪苓之间巨噬细胞吞噬率、CD86的表达增加,有一定的浓度梯度依赖性。低浓度猪苓组巨噬细胞CD40表达百分率显著升高(P0.05);而猪苓组中剂量和高剂量组CD40的表达百分率与模型组比较无统计学差异。低剂量猪苓组TLR4/CD14的表达百分率与模型组无显著性差异(P0.05)。中、高剂量猪苓组TLR4/CD14的表达百分率与模型组比较则显著降低(P0.05);模型组腹腔巨噬细胞NO释放的比值LPS(+)/LPS(-)与空白对照组比较明显升高(P0.05),而PPS组与模型组比较则显著降低(P0.05),不同浓度猪苓组与模型组比较NO释放的比值均显著显著降低(P0.05); 3 PPS组癌旁上皮CD86的表达强度明显增强。肿瘤间质浸润的淋巴细胞与肿瘤上皮CD86的表达成一定的正相关关系。CD40在膀胱移行细胞癌中高表达,明显高于无瘤膀胱组织,高分化膀胱癌表达明显,表达随分化程度逐渐减弱。乳头状瘤及异常增生的上皮组织,CD40散在表达于上皮的游离缘和伞细胞上,而间质广泛表达。PPS组膀胱癌移行上皮NF-kB p65的表达与模型组相比明显减弱。同一病理分级的移行细胞癌,PPS组PPARγ的表达明显增强,低剂量、中剂量和高剂量猪苓组PPARγ在移行上皮的表达则明显减少,仅在上皮中的伞细胞上散在表达。PPS组明显上调PPARγmRNA表达水平;PPS组TLR2mRNA的表达水平相对于模型组升高,低剂量、中剂量和高剂量猪苓组TLR2mRNA的表达水平均升高,其中低剂量猪苓组TLR2mRNA的表达水平与模型组有显著差异(P0.05)。PPS组TLR4mRNA的表达水平明显升高,低剂量、中剂量和高剂量猪苓组TLR4mRNA的表达水平均升高,其中高剂量猪苓组TLR4mRNA的表达水平与模型组比较有显著差异(P0.05)。 4 PPS可明显提高T24膀胱癌细胞PPARγmRNA、蛋白的表达水平,且PPARγ拮抗剂BADGE可阻断PPS升高PPARγ表达的作用; 结论 1猪苓和猪苓多糖可对BBN诱导大鼠膀胱癌具有一定的预防作用,降低BBN诱导的大鼠膀胱癌的病变程度,将肿瘤抑制在其发生发展过程中的不同阶段。猪苓多糖可能主要通过TLR4信号通路启动天然免疫,激活巨噬细胞,诱导共刺激分子的表达,抑制NF—kB过度活化,上调PPAR y的表达,抑制膀胱癌的发生和进展; 2 PPARγ表达水平的升高是猪苓多糖对人膀胱癌T24直接作用的一条途径,且PPS是通过PPARγ依赖途径发挥抗肿瘤作用的。 第二部分 结果 1 BCG灌注第六周后,BCG组CD3+、CD4+CD3+、CD8+CD3+、CD25+CD3+的T淋巴细胞的百分率(均值)与模型组相比均无显著性差异,但此时,PPS+BCG组CD8+CD3+CD25+CD3+与模型组比较均显著升高(P0.05)。灌注第十二周后,BCG组CD3+、CD4+CD3+的T淋巴细胞的百分率(均值)与模型组比较均升高;PPS+BCG和ZL+BCG组比单独BCG组CD3+、CD4+CD3+、CD8+CD3+、CD28+的T淋巴细胞的百分率(均值)升高; 2 BCG组巨噬细胞表面CD86、CD40的表达与模型组比较升高,但无显著性差异(P0.05)。PPS协同BCG组巨噬细胞表面CD86、CD40的表达与模型组比较均显著升高(P0.05)。猪苓协同BCG组CD86、CD40的表达介于模型组与空白对照组之间,与两者均无显著性差异(P0.05)。BCG组腹腔巨噬细胞TLR4/CD14的表达显著升高(P0.05)。BCG联合PPS明显低于单独BCG组。BCG组NO释放的比值LPS(+)/LPS(-)与模型组比较无显著性差异;均较空白对照组显著升高;BCG联合PPS组及BCG联合猪苓组与模型组比较NO释放的比值均显著降低(P0.05)。 3 PPS联合BCG组CD86的表达及CD40的表达均明显增强,间质细胞上皮细胞的细胞核NF-kB的表达增强。BCG可显著上调PPARγmRNA、TLR4mRNA的表达(P0.05)。BCG联合猪苓多糖组均明显上调TLR2 mRNA、TLR4mRNA表达水平,差异显著(P0.05)。 4 rHSP70分别刺激J774细胞24小时培养24h后,TLR4的表达与对照组没有明显的变化;共培养48h后,TLR4的表达与对照组相比明显升高,且存在剂量依赖性。rHSP70刺激J774细胞48小时后,NF-kB的表达主要以细胞核表达为主,相对于对照组明显升高。 结论 BCG具有抑制膀胱癌发生的作用,PPS能协同BCG直接抑制膀胱癌细胞的增殖和调节免疫细胞的功能,其协同作用优于BCG的单独作用,TLR传导途径的激活发挥着关键作用,其中,猪苓多糖可同时激活抗炎信号途径,抑制NF—kB的活化及抑制NO的释放,降低BCG局部炎症所造成的组织损伤,从而发挥其减毒增效的作用。


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