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参芪水提液纯化技术筛选研究

张来华  
【摘要】: 目的: 以参芪扶正方为研究对象,应用醇沉工艺、澄清剂絮凝、大孔树脂和葡聚糖凝胶吸附纯化等技术对其水提液进行单用和联用纯化研究,筛选最佳纯化工艺,为参芪水提液纯化以及参芪注射液产品质量提升奠定了良好的基础和依据。 方法: 采用紫外分光光度法测定总皂苷和总糖含量;采用高效液相-紫外-蒸发光联合技术建立黄芪甲苷、芒柄花素含量测定方法和指纹图谱分析方法;采用薄层色谱法进行鉴别和分析。以沉淀量为指标,对壳聚糖、ZTC1+1Ⅲ型澄清剂,果汁澄清剂等澄清剂进行研究,筛选最佳澄清剂。以总皂苷、总糖和黄芪甲苷、芒柄花素含量为指标,分别采用正交法对壳聚糖澄清法、壳聚糖-乙醇联用技术、大孔树脂-葡聚糖凝胶联用技术以及醇沉法进行研究,辅以纯化液固含物量和指纹图谱分析,筛选参芪水提液的最佳纯化工艺。 结果: 1.含量测定方面研究表明:总糖以吸光度(Y,A)对浓度(X,mg/mL)进行线性回归,得标准曲线方程:Y=10.905X+0.1394;r=0.999 8,总糖在0.08~0.24 mg范围内呈线性关系;总皂苷以吸光度(Y,A)对黄芪甲苷毫克数(X,mg)绘制标准曲线,线性方程为:Y=2.3409 X+0.0252,R=0.999 6,黄芪甲苷在0.031~0.188 mg范围内呈线性关系;黄芪甲苷以峰面积的对数与进样量的对数做标准曲线,得标准曲线为Y=1.3351X+2.3674,r=0.999 8,表明黄芪甲苷进样量在0.057μg~1.14μg范围内呈良线性关系好;芒柄花素以峰面积对进样量做标准曲线,得标准曲线为Y=5152.3X-101.39,r=0.999 9,表明芒柄花素进样量在0.026μg~0.416μg范围内呈良好线性关系。 2.指纹图谱分析方法研究表明:以水提液为研究对象,以乙腈和水为流动相通过梯度洗脱,分别以芒柄花素和黄芪甲苷为指标,在254 nm紫外光谱图中共分离出11个主要色谱峰,11号峰为芒柄花素;在蒸发光图谱中共分离出12个主要峰,6号峰为黄芪甲苷;各峰分离度好、塔板数均在5000以上,基线平整,经方法学考察,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD均小于1.4 %。 3.不同澄清剂筛选研究表明:药液浓度和澄清剂加入量对沉淀量有较多影响,以壳聚糖所得沉淀量最高,澄清效果要优于ZTC1+1和101果汁澄清剂。 4.壳聚糖研究表明:加入量对参芪水煎液中黄芪甲苷、总糖和皂苷总含量具有显著影响;加入量和絮凝温度对芒柄花素含量存在显著性差异。综合分析得最佳工艺为A2B2C2D1,该工艺总皂苷与总糖的含量达51.70 %,芒柄花素含量达0.02614 %,黄芪甲苷含量达0.1907 %。固含物量40.29 mg/mL。HPLC-UV-ELSD指纹图谱和TLC分析表明,不同工艺样品中出峰个数和斑点数基本一致,但在含量上存在一定差异。 5.水提醇沉工艺研究表明:醇沉法芒柄花素含量可达0.025 %,黄芪甲苷含量可达0.16 %,总皂苷与总糖的含量可达50.89 %,固含物量36.95 mg/mL,且蒸发光图谱显示5~10min之间峰分离度较好,噪音小,基线较平。 6.壳聚糖-乙醇、大孔树脂-葡聚糖凝胶联用技术研究表明:加入少量乙醇对壳聚糖沉淀效果具有一定的促进作用,固含物低于醇沉法;以大孔树脂吸附总皂苷黄酮类和葡聚糖凝胶法分离总糖类,其纯化效果明显提高,所得纯化样品中固含物较少,所含皂苷黄酮类、总糖类、芒柄花素和黄芪甲苷的含量均较高,其中芒柄花素含量可达0.03960 %;黄芪甲苷含量可达0.483 %;总皂苷与总糖的含量可达74.82 %,固含物量16.17 mg/mL。通过HPLC指纹图谱分别比较了不同纯化工艺的紫外和蒸发光指纹图谱可知,不同纯化技术的HPLC指纹图谱整体面貌与参芪水提液基本保持相似,但以大孔树脂-葡聚糖凝胶联用技术分离出的峰多,基线较平,杂质所造成的噪音较小;254nm紫外图谱中共分离出16个信息峰,16号峰为芒柄花素,蒸发光指纹图谱共分离出14个信息峰,14号峰为黄芪甲苷。TLC分析表明,以V二氯甲烷:V甲醇:V水(13:9:2)为展开剂,可以得到较多斑点,而且分离度好,各不同纯化方法的薄层色谱中斑点的大小和颜色存在差异,表明不同工艺对成分纯化具有一定影响。 结论: 1.通过方法学考察,总糖和皂总苷紫外分光光度法精密度、稳定性、重复性均达到要求,可用于测定参芪中总糖、总皂苷含量。建立的芒柄花素、黄芪甲苷含量测定以及指纹图谱分析的HPLC-UV-ELSD方法,其精密度、稳定性、重复性均达到要求,可用于参芪HPLC指纹图谱分析水提液及纯化液的成分变化,能从整体上对参芪纯化前后各成分的变化情况进行分析,比较不同纯化工艺对参芪水提液的影响。建立的TLC图谱可用于分析水提液及纯化液的成分变化,比较不同纯化工艺对参芪水提液的影响。 2.单用和联用纯化方法表明,壳聚糖澄清法具有较好的沉淀效果,且加入少量乙醇能明显提高沉淀速度和沉淀量;水提醇沉具有良好的沉淀效果,但有效部位多糖也被大量除去,不利于更好的发挥制剂疗效;采用大孔树脂分离皂苷黄酮类-葡聚糖凝胶分离多糖类的联用技术具有更为优良的纯化效果,所得固含物少,成分含量较高,指纹图谱特征峰多且高、基线平整。 3.综合分析研究表明,以大孔树脂-葡聚糖凝胶联用技术纯化参芪水提液的工艺最佳,该工艺稳定、有效成分含量高、杂质少等特点,且所建立的分析评价方法能很好的用于该工艺产物的质量评价。


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