抗MRSA活性蜚蠊肠道球孢链霉菌WA5-2-37次级代谢产物的初步研究

【摘要】：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)对临床上常见的抗生素呈耐药特性,号称“超级细菌”。据统计,目前全球MRSA的感染率已超越乙型肝炎和艾滋病,稳居世界难解决感染性疾病的首位。因此,研发新型、安全、高效的治疗MRSA感染的药物变得更加迫切。昆虫肠道内生微生物与宿主的营养物质摄取、生长发育以及抵御病原体入侵等生理功能密切相关。且昆虫肠道内环境与土壤、植物相比存在特殊性,其肠道内环境中的共生微生物的代谢途径可能在某种程度上受到昆虫宿主肠道特殊环境的激活与调控,使这一类特殊来源的微生物更具有产生结构新颖、活性良好的天然产物的可能性。本课题组前期从蜚蠊肠道中分离得到18株具有抗MRSA活性的菌株。本文以MRSA作为指示菌,选取这18株菌中抗MRSA活性较好的菌株WA5-2-37为研究对象,并综合运用形态学、分子生物学及系统发学等一系列的方法对菌株进行了初步的鉴定。同时,经单因素优化法和响应面分析法对菌株WA5-2-37的发酵条件进行优化后,扩大其发酵规模,并以化学分离结合活性追踪的手段,对菌株WA5-2-37所产生的抗MRSA活性次级代谢产物进行初步的研究。本论文主要结果如下:1、抗MRSA活性蜚蠊肠道内生放线菌的筛选:通过琼脂扩散法、滤纸片法等方法,以MRSA作为指示菌,筛选出菌株编号为WA5-2-37的抗MRSA活性较好的蜚蠊肠道内生放线菌,该菌株的抑菌圈直径可达22.30±0.42 mm。2、菌株WA5-2-37的分类鉴定:利用培养基生长特征分析、革兰氏染色、扫描电子显微镜等手段对菌株WA5-2-37的生长形态进行观察,并对菌株16S r DNA序列进行比对结果和系统发育树结果进行分析。综合分析上述研究结果,可初步鉴定菌株WA5-2-37为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus),该菌株的16S r DNA序列在NCBI的登录号为MH304280。3、菌株WA5-2-37发酵条件的优化:通过单因素优化法和响应面分析法对菌株WA5-2-37的发酵条件进行优化。以MRSA作为指示菌,确定菌株WA5-2-37的最佳发酵条件为种龄34 h、接种量7%、发酵时长7天、发酵培养基初始p H值6.9、装液量300 m L/500 m L、培养温度29.8℃、摇床转速160 rpm/min。在此条件下菌株WA5-2-37发酵产物的抗MRSA活性最好,抑菌圈直径可达23.82±0.21mm。4、菌株WA5-2-37抗MRSA活性次级代谢产物的分离纯化及结构鉴定:根据菌株WA5-2-37的最佳发酵条件,对菌株进行扩大发酵。通过TLC、硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱层析、HPLC、Semipreparative HPLC等方法,并结合活性追踪,对菌株的抗MRSA活性次级代谢产物进行分离纯化。同时,利用NMR、MS等波谱学方法,对从菌株活性次级代谢产物中分离得到的8个化合物进行结构解析,化合物1~8依次为:邻苯二甲酸二丁酯、放线菌素X2、(6E)-4-甲氧基-5-(甲基砜)-6-(亚硝基亚乙基)-1,6-二氢-2′-联吡啶、7-甲氧基-5-(2-吡啶基)异噻唑并[4,5-b]吡啶、3-氨基脱甲基(氧基)氨甲酰胺、环-(丙-脯)-二肽、环-(缬-脯)-二肽和环-(L-脯-L-酪)-二肽。5、单体化合物抗菌活性评价:对分离所得的化合物对MRSA、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的生长活性进行测定。结果显示,化合物放线菌素X2和(6E)-4-甲氧基-5-(甲基砜)-6-(亚硝基亚乙基)-1,6-二氢-2′-联吡啶对四种病原菌均具有较强的活性,其他化合物对四种病原菌均具有不同程度的抑菌活性。