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大麻二酚对急性应激肺损伤的保护作用及其机制研究

叶程龙  
【摘要】:急性应激反应是由剧烈的精神刺激或持续困境的作用下引发的应激障碍,其常表现在患者的心理和生理层面。目前对于此类病症的常用治疗手段常以心理干预治疗为主,但这种治疗并不能解决应激所导致的身体疾病问题且无法起到预防保护作用。鉴于青春期情绪急剧变化的青少年的心理疾病和处于压力状态下的中老年人群,由于急性应激导致的亚健康问题和疾病如失眠、不同程度的抑郁、情感障碍和精神分裂等疾病的逐渐高发已成为不容忽视的危害人民健康的重大问题,发现情感障碍应激的原因,对其进行尽早干预和治疗,寻找出高效低毒的抗应激新药显得极为重要。大麻二酚提取自植物大麻,其具有一定的抗焦虑抗应激作用,但是长期连续使用却没有大麻致幻成瘾的毒副作用,因此将大麻二酚应用于抗应激药物及保健品的研发上具有重要的开发前景。本课题组在前期研究中,通过低温水浸束缚大鼠应激模型,研究发现造模成功后的急性应激大鼠肺脏出现明显水肿炎症、变性和坏死等损伤。研究大麻二酚对应激所致肺损伤的药理学效应并阐明其作用机制,为开发新型抗应激性肺损伤新药和功能性食品奠定理论基础。本文通过以下几个方面对大麻二酚的抗应激作用及其机制进行研究:第一部分:本文通过低温(20℃)水浸束缚建立急性应激大鼠肺损伤模型并将成功建模的急性应激大鼠随机分为如下几组:空白对照组、模型组、大麻二酚灌胃组高(108mg/kg)、中(36mg/kg)、低(12mg/kg)剂量组,以探讨大麻二酚的抗急性应激性肺损伤的药理学效应,结果发现:(1)模型组中的动物肺组织脏器系数、湿重/干重比(W/D)均高于空白组(p0.01);而与模型组相比较,大麻二酚中、高剂量组肺脏器系数和W/D值均显著降低并呈剂量依赖性,说明中剂量(36 mg/kg)灌胃大麻二酚即可表现出一定程度的对抗肺水肿等急性损伤作用。(2)利用ELISA试剂盒检测大鼠血清中皮质酮(CORT)、TNF-α和IL-1β等细胞因子的水平,结果显示,模型组动物血清中CORT、TNF-α和IL-1β水平相比空白组均有显著升高(p0.01),而大麻二酚中、高剂量组动物血清中的CORT、TNF-α和IL-1β水平均比模型组动物血清中的相应指标呈现显著下降(P0.05),说明急性应激发生时能促使机体大量炎症细胞因子的产生和释放,而大麻二酚则通过抑制体内炎性细胞因子的释放而产生抗应激作用。(3)进行病理组织学检测,HE染色结果显示,模型组中动物的肺组织水肿、肺泡壁显著增厚,肺泡结构出现变形坍塌并伴有大量炎细胞浸润,而大麻二酚各剂量组均呈剂量依赖性抑制肺组织炎细胞浸润及肺泡结构变化,并抑制纤维化等重构的病理学特征的发生。通过组织学HE染色和细胞因子检测等指标,证明急性应激大鼠肺组织损伤动物模型的成功建立,提示中、高剂量的大麻二酚能抑制炎性细胞因子的产生和急性肺水肿、炎性性变和组织结构的破坏等病理样变,为防治慢性阻塞性肺病(COPD)提供了科学依据。第二部分:本课题组通过第一部分实验发现大麻二酚具有显著的抗急性应激大鼠肺部损伤的药理学效应,本部分内容通过体外实验方面系统研究其抗急性应激大鼠肺部损伤的药理作用机制:首先建立TBHP(叔丁基过氧化氢)诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞A549氧化应激损伤模型,并设置空白组、模型组和大麻二酚高、中、低剂量组,进行以下体外细胞实验:(1)通过MTT 比色法确定符合细胞造模要求的TBHP浓度(200 μmol/L)和大麻二酚的无毒剂量并按分组进行实验。结果发现相对模型组55.3%的细胞存活率,大麻二酚能呈剂量依赖性对TBHP所诱导的细胞损伤起到干预保护作用,其细胞存活率分别为:60.5%(1.25μmol/L)、73.4%(2.5μmol/L)和82.2%(5μmol/L)。(2)在确认大麻二酚对TBHP诱导细胞损伤的抗氧化应激作用后对其抗凋亡机制进行系统性研究。利用Hoechst33258染色法定性观察药物以浓度依赖性发挥抗凋亡作用,细胞核染色结果显示5 μmol/L的大麻二酚能起到明显保护作用。(3)采用流式细胞术进行定量分析,通过Annexin V/PI双染法和DCFH-DA染色检测各组细胞的凋亡情况和活性氧生成率。结果显示5 μmol/L大麻二酚能显著降低TBHP诱导细胞内活性氧水平,且其12.88%的凋亡率相比模型组34.5%凋亡率具有显著降低。这提示大麻二酚可能是通过降低TBHP引起的高活性氧水平起到抗凋亡作用。第三部分:为进一步探索大麻二酚抗急性应激大鼠肺部损伤的分子药理学机制,本课题组先通过转录组测序技术结合基因差异分析和KEGG功能富集分析的结果,筛选出应激大鼠体内基因异常表达的靶标基因p38MAPK,再采用蛋白免疫印迹法检测p38MAPK蛋白及其下游凋亡相关蛋白的表达:(1)细胞水平分子机制研究,采用Western Blot法检测细胞p38MAPK通路的激活程度,结果发现大麻二酚能通过抑p-p38MAPK、Bax和Cleaved-Caspase3的表达水平并上调Bcl-2蛋白表达水平产生抗凋亡作用。(2)动物体内水平分子机制研究,采用Western Blot检测大鼠急性应激肺组织中关键蛋白的表达,结果发现高剂量组大麻二酚能对抗急性应激导致p38MAPK信号通路的激活,并能显著下调下游Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达以及提高Bcl-2蛋白水平,由此产生对急性应激大鼠肺损伤的保护作用。综上所述,大麻二酚对急性应激导致大鼠肺部损伤有保护作用,其保护机制与抑制p38MAPK应激通路的激活,下调Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达,进而减轻氧化应激损伤、抑制炎症细胞因子的产生和释放有关。提示大麻二酚在对抗应激相关疾病中具有较好的保护作用,并为开发新型抗急性肺应激性损伤新药和功能性食品提供理论依据。


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