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番茄钙依赖性蛋白激酶的生化鉴定和功能分析

畅文军  
【摘要】:以烟草钙依赖性蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinases, CDPKs or CPKs) NtCPK5 (AY971376)的cDNA序列为信息探针,运用blastn程序搜索番茄EST数据库,对重叠的序列进行拼接,并根据拼接结果,设计特异引物进行RT-PCR,从番茄中分离出一条长1982 bp的cDNA片段,其序列与电子克隆的结果一致,包含一个1698 bp的开放阅读框,编码565个氨基酸,将其命名为LeCPK2 (GenBank GQ205414)。 序列分析显示,LeCPK2同其它植物CDPKs具有很高的同源性,具有CDPKs典型的保守结构域:激酶催化结构域、自抑制结构域和钙调素类似结构域。在进化上处于CDPKs和CRKs(CDPK-related protein kinases)之间。 以获得的LeCPK2 cDNA序列为信息探针,搜索番茄基因组数据库,找到其所属的注释基因,根据注释基因所属的contig,找到其上游序列,并根据所获得的序列设计引物,从番茄DNA中扩增得到长约1700 bp的LeCPK2启动子序列。序列分析显示,LeCPK2可能是一个TATA-less启动子,不具有典型的TATA-box。LeCPK2的调控序列中含有多个光响应元件和热胁迫应答元件,同时含有10个和授粉激活相关的元件和一些激素和真菌胁迫应答元件,说明其可能在植物的光合作用、光周期调节的生长发育或者光胁迫应答中发挥重要作用。另外,含有多个热胁迫应答元件和授粉启动相关元件,说明LeCPK2可能和植物的耐热性及授粉过程相关。 构建了全长和截短LeCPK2重组蛋白,活性分析显示,LeCPK2的活性是钙依赖性的,截去了其C末端的CaM-like结构域的截短蛋白,其活性被抑制并不再受钙离子激发,说明CaM-like结构域通过结合Ca2+来激活CDPKs活性的,这符合CDPK蛋白的酶活调节机制。酶学特性研究显示,以多肽syntide 2为底物时,酶促反应所需的最佳Mg2+浓度为10 mM,以histoneⅢs为底物时,最佳浓度为20 mM。以syntide 2为底物时,LeCPK2达到最大活性1/2时所需要的Ca2+浓度(K0.5)为45.5 nM;以histoneⅢs为底物时,K0.5值为48.8 nM。利用两种不同的底物来考察LeCPK2活性对底物的特异性,结果显示,以histoneⅢs为底物时,LeCPK2达到最大活性1/2时所需要的底物浓度(Km)为44.9μg/ml,以syntide 2为底物时,Km值为89.52μM。 半定量RT-PCR结果表明LeCPK2在各器官中都有表达,花中表达最多,根和叶片中次之,茎和果实中表达较少。LeCPK2没有参与盐、干旱以及低温胁迫的应答反应,而对热、机械伤害和激素乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)胁迫起应答反应,并且对机械伤害及三种激素的应答模式基本相同,都在处理30 min表达增加,并一直持续到处理后3h表达量才恢复到正常水平。以上结果同时表明, LeCPK2对环境胁迫的应答反应同启动子顺式作用元件分析的结果—致。 通过农杆菌介导的叶盘转化法将LeCPK2转入烟草中进行生理功能的分析,结果显示,在42℃热处理10h后,对照和转基因植株均不会出现明显的表型变化。热处理后将对照和转基因植株放在强光下处理1h,对照植株叶片出现明显的萎蔫,体内丙二醛含量升高,而转基因植株和热处理后在室内弱光下恢复生长的对照植株并未出现明显的表型变化,说明热损害表型的出现是由光诱导的,可能是光氧化胁迫(photooxidation)造成的。将未受热处理的对照植株和热处理后的对照植株一同进行光处理,未经热处理的植株并不会出现萎蔫现象,说明在强光下发生的损害表型是由于热处理的影响而并非光本身造成的伤害。转基因植株在热处理后放在强光下恢复生长,表现正常,并未出现叶片萎蔫现象,说明LeCPK2在植株耐热反应中发挥了重要功能。


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