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香蕉枯萎病菌两个新基因的敲除和功能初探

羊玉花  
【摘要】:尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)引起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害。为了给深入研究FOC与拮抗真菌,FOC与香蕉之间互作的分子机理提供理论依据,本研究从尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4, FOC4)的基因库中挑选了推测的两个相关基因FOC4B_001、FOC4B_003,对他们进行基因敲除,分析它们的表型变化,初步确定它们在尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中的作用。 对编码的氨基酸序列进行分析,发现基因FOC4B_001具有GTP结合位点、环化腺苷酸作用位点、G蛋白β-γ亚基复合体结合位点,假设的膜受体结合位点。同时氨基酸序列比对结果显示,该序列与粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)、木霉(Trichoderma)、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的G蛋白α亚基氨基酸序列具有较高同源性,但与已知的两个尖孢镰刀菌的G蛋白α亚基同源性较低,推测该基因为FOC4的一个新的G蛋白α亚基基因。基因FOC4B_003为FOC4的特有基因,对其编码的氨基酸序列进行分析,发现该基因产物具有一段约150个氨基酸残基大小的异核体不亲和蛋白(heterokaryon incompatibility proteins, HET)的保守基序,推测该基因与异核体不亲和相关。 为了解这两个基因的作用,本实验对这两个基因进行基因敲除。首先利用带有绿色荧光蛋白基因的DNA片段进行原生质体转化,得到绿色荧光蛋白标记的FOC4菌株,确定了FOC4原生质体转化体系。随后构建了2个敲除载体,并用限制性内切酶将用于转化的片段切下,通过原生质体转化,将含有同源序列的DNA片段转化至FOC4中,获得基因缺失突变体,其中FOC4B_003基因缺失突变体具有绿色荧光蛋白基因。突变体表型分析发现,两个基因缺失突变体在菌丝形态上与野生型有些差异,并且都表现出耐热性的提高。而在菌落形态,孢子形态,生长速率与野生型并没有太大差异。在与其他真菌的对峙培养实验中,FOC4B_003基因缺失菌株表现出对供试的木霉菌具有一定的抗性,而野生型FOC4菌株没有抗性,表明该基因在FOC4与其他真菌的互作中具有一定的作用。在致病性上,两个基因缺失突变体与野生型无明显差异。 本实验通过分析FOC4两个基因核酸序列及氨基酸序列,和利用基因敲除方法初步探索两个未知基因的功能,为深入研究两基因的生物学功能奠定了基础。同时本实验还确定了香蕉枯萎病病原菌的基因敲除体系,为该病原菌基因库中其他基因的功能研究提供了技术支持。


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