耐寒转基因木薯田间检测与木薯耐寒基因的克隆和功能分析

【摘要】：寒冷是限制植物生长的重要原因之一,每年因寒害、冷害造成的损失可达数千亿美元。木薯(Manihot esculenta)是一种起源于热带的冷敏感型作物,可作食用、饲用、加工淀粉及燃料酒精,是一种十分具有开发利用价值的热带能源作物。但因其对寒冷十分敏感,10℃的低温即可对其造成伤害,因此,研究木薯抗寒具有重要意义。但是因为木薯基因高度杂合,传统的育种方式由于筛选时间长、工作量大,变异不可控等原因已逐渐被抛弃,取而代之的是采用现代分子生物学手段,将目的基因转入植株体内,以期改良木薯品质。前人的研究发现CBF (C-repeat Binding factor)转录因子可与COR(cold-regulated)基因结合,激活下游一系列抗寒相关基因表达,从而提高植物体耐寒性。本研究从大田转基因木薯田间农艺性状的观测和抗寒生理指标的测定出发,比较分析了转基因木薯与对照华南8号之间的差异,初步筛选出表型和产量正常、抗寒性优良的转基因株系。同时从木薯中克隆出与拟南芥CBF3基因同源的木薯CBF基因,命名为MeCBF1(GenBank登录号为：JQ339740),构建了植物表达载体pVKH-35S-MeCBF1-pA,转入拟南芥中进行遗传转化研究,并利用荧光定量PCR技术研究了MeCBFl的时空表达特性,结果如下： 1.综合各指标的测定和田间形态观察,除转基因株系84(2)外,其余转基因株系抗寒性都有一定程度的提升,产量和表型与对照无明显差异。 2.转入抗寒基因CBF3的木薯植株,在农艺性状及抗寒相关生理指标方面有所改变：株高、茎粗比对照变小,叶面积均大于对照。叶绿素含量高于对照,可溶性蛋白、游离脯氨酸含量在寒冷季节高于对照,抗寒性得到了一定程度的提升。 3.根据phytozome网站预测的木薯基因组信息设计了一对引物,引入酶切位点BamHI和Sal I,以木薯总DNA为模板克隆出木薯CBF基因,命名为MeCBFl,将该基因和实验室提供的pVKH-35S-GUS-pA进行双酶切,T4连接酶连接,得到木薯MeCBFl基因植物表达载体pVKH-35S-MeCBF1-pA。 4.将植物表达载体pVKH-35S-MeCBF1-pA转入农杆菌中,通过农杆菌介导法把MeCBFl基因转入拟南芥中,得到抗性植株,可进一步用于基因功能鉴定。 5.将得到的MeCBFl基因进行测序,测序结果表明,此基因为1037bp,完整的开放阅读框架从第102位开始,到第795位出现终止密码子,共696个核苷酸序列,编码231个氨基酸。将所得序列与GenBank上其他物种的CBF基因进行比对,发现木薯MeCBF1基因与同为大戟科的橡胶HbCBFl、蓖麻LREBF1基因相似性最高,分别为91%和89%。 6.将木薯置于4℃低温下,处理0h、1h、2h、4h、6h、8h,提取冷处理不同时间后木薯幼苗的根、茎、叶RNA,反转录成cDNA后,进行荧光定量PCR,研究冷处理不同时间后,MeCBF1基因的表达量随时间的变化。结果表明,MeCBFl基因的表达峰值出现在冷处理2h时,随后表达量降低并维持在低水平,另外,MeCBF1基因的表达量在根、茎、叶中有所不同,在茎中的表达量最高,其次为叶片,在根中的表达量最少。