木薯遗传图谱10个标记位点的物理定位

【摘要】：木薯(Manihot esculenta Crantz)是一种重要的能源植物。目前,国内外众多研究者已采用多种标记方法构建出了部分木薯分子遗传图谱,但其遗传图谱均未能达到饱和。在已发表的木薯遗传图谱中,有些图谱的连锁群数目大于18个,有些图谱的连锁群数目为18个。除本课题组王超(2012)初步对Chen等(2010)发表的9号、17号、18号连锁群与其相应的染色体进行了整合外,绝大多数的遗传图谱连锁群与核型的对应关系尚未揭示。针对这种情况,本实验采用荧光原位PCR技术对从木薯遗传图谱上选取的10个标记位点进行了物理定位,并将这些标记位点所在的相应连锁群与核型进行了对应整合,不仅可为木薯分子细胞遗传图谱的构建奠定基础,还可为木薯选育种、基因工程、种质资源鉴定、比较基因组学等研究提供细胞遗传学依据。本实验的研究结果如下： 1.从Chen等(2010)发表木薯遗传图谱上的16号连锁群两端各选取1个标记合成NS376-L16和SSRY86-L16共2对引物。其中引物NS376-L16能在木薯华南6号上扩增出一个大小约为200bp的片段；引物SSRY86-L16能在华南6号扩增出一个大小约为295bp的片段。从Sraphet等(2011)发表木薯遗传图谱上的3号、4号、8号连锁群两端各选取1个标记,从14号、16号连锁群上各选取1个标记,共选取8个标记合成SSRY180-L3、SSRY252-L3、NS368-L8.NS308-L8、SSRY80-L16、NS271-L14、SSRY75-L4、 NS356-L4共8对引物。其中引物SSRY180-L3能在木薯华南6号上扩增出两个片段,大小约为140-190bp之间；引物SSRY252-L3能在木薯华南6号上扩增出一个大小约为230bp的片段；引物NS368-L8能在木薯华南6号上扩增出两个片段,大小约为180-220bp之间；引物NS308-L8能在木薯华南6号上扩增出一个大小约为140bp的片段；引物SSRY80-L16能在木薯华南6号上扩增处一个大小约为280bp的片段；引物NS271-L14能在木薯华南6号上扩增处一个大小约为220bp的片段；引物SSRY75-L4能在木薯华南6号上扩增出一个大小约为320bp的片段；引物NS356-L4能在木薯华南6号上扩增出两个片段,大小约为240-300bp之间。 2.对王超(2012)已建立的木薯原位PCR体系的部分步骤进行优化。原位PCR扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性30s,55℃退火30s(根据引物的Tm值上下浮动),72v延伸30s,共35个循环,然后72℃延伸5min,最后16℃保存10min。扩增后处理流程为：0.1×PBS37℃洗脱5min→5%BSA37℃孵育20min→50μl Anti-DIG-Fluorescein(20μg/ml)37℃孵育1h→0.1×SSC/吐温20洗脱2×5min→25μl DAPI混合液(用抗淬灭剂DABCO对DAPI进行稀释,并使得DAPI的终浓度达到2μg/mL)封片→荧光检测。 3.通过对Chen等(2010)发表木薯16号连锁群两端的NS376和SSRY86两个标记进行原位PCR定位研究,将NS376标记和SSRY86标记依次定位在华南6号的4号染色体的短臂和长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离依次为31.25和75.86。经过核型分析,发现NS376和SSRY86两个标记被定位于同一对染色体上,并分别位于该染色体的两端,进一步揭示了Chen等(2010)所发表的16号连锁群对应的是木薯的4号染色体。 4.通过对Sraphet等(2011)发表的木薯3号连锁群两端的SSRY180和SSRY252标记进行原位PCR定位研究,将SSRY180标记和SSRY252标记依次定位在华南6号的7号染色体的短臂和长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离依次为67.39和30.12。经过核型分析,发现SSRY180和SSRY252两个标记被定位于同一对染色体上,并分别位于该染色体的两端,进一步揭示了Sraphet等(2011)发表的3号连锁群对应的是木薯的7号染色体。 5.通过对Sraphet等(2011)发表的木薯8号连锁群两端的NS368和NS308标记进行原位PCR定位研究,将NS368标记和NS308标记依次定位在华南6号的5号染色体的短臂和长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离依次为83.34和40.46。经过核型分析,发现NS368和NS308两个标记被定位于同一对染色体上,并分别位于该染色体的两端,进一步揭示了Sraphet等(2011)发表的8号连锁群对应的是木薯的5号染色体。 6.从Sraphet等(2011)发表的木薯16号连锁群一端选取SSRY80标记和从14号连锁群一端选取NS271标记进行原位PCR定位研究,将SSRY80标记和NS271标记依次定位在华南6号的13号染色体的短臂和长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离依次为69.30和53.44。经过核型分析,发现SSRY80和NS271两个标记被定位于同一对染色体上,并分别位于该染色体的两端,进一步揭示了Sraphet等(2011)发表的16号、14号连锁群对应的是木薯的13号染色体,并初步揭示出这两个连锁群可能可以整合成一个新的连锁群。 7.通过对Sraphet等(2011)发表的木薯4号连锁群两端的SSRY75和NS356标记进行原位PCR定位研究,将SSRY75标记和NS356标记依次定位在华南6号的6号染色体的短臂和长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离依次为25.70和63.47。经过核型分析,发现SSRY75和NS356两个标记被定位于同一对染色体上,并分别位于该染色体的两端,进一步揭示了Sraphet等(2011)发表的4号连锁群对应的是木薯的6号染色体。