海南土著芽孢杆菌筛选、复合及其水质净化效果研究

【摘要】：海南省是我国养殖水产品出口大省,沿海水质优良,水产品质量高,而且种类丰富。然而,近年来集约化养殖的迅速发展大大增加了水体的有机负荷,养殖水体环境日趋恶化,导致病害频繁发生,给该行业造成严重损失。目前,使用安全高效、绿色环保的微生物制剂改善养殖环境,减少病害发生是保持水产养殖业健康可持续发展的重要措施。芽孢杆菌是公认的一种优良的微生态菌,是水产养殖业中最有效的水质净化菌之一。针对海南地理环境特殊,外来菌种使用效果不理想的现象,本论文从海南文昌市会文镇海水养殖系统中分离筛选并鉴定了2株高蛋白酶活性和4株高脂肪酶活性的海南土著芽孢杆菌,并对2株高蛋白酶活菌株和其中1株高脂肪酶活菌株相复合时的最佳配比用量和复合后的水质净化能力做出了研究,具体结果如下： 1.用芽孢杆菌选择性培养基(温度50℃,盐度70),从文昌市会文镇海水养殖系统水样和泥样中初步分离出247株芽孢杆菌；以从一种常见微生物制剂中分离的2株芽孢杆菌SP11001和SP11002作为对照,采用脱脂牛奶平板法筛选出2株高蛋白酶活菌株WC11011和WC11148,其蛋白酶活性均极显著高于对照菌株(P0.01)。经菌落表型分析、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该两株目标菌株均为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)浸泡于菌浓度为1×107CFU/mL的水体中进行48h急性攻毒试验,结果表明,这两株菌对水产养殖动物是安全的。当投放量为2×105CFU/mL时,对于灭菌养殖废水中的脱脂牛奶(5%),2株细菌均可在12h内将其完全降解；对于不灭菌养殖废水中的脱脂牛奶(5%),WC11148在12h时,能将其大部分降解,而WC11011只需8h就能将其完全降解。 2.将采集的水样和泥样经富集培养、油脂同化平板初筛、菌种分离、摇瓶发酵及脂肪酶酶活测定,共筛选出4株高脂肪酶活性的芽孢杆菌,其脂肪酶活性分别为14.6U/mL (WC11225)、9.75U/mL(WC11023×10.24U/mL (WC11021)和7.66U/mL(WC11041)。经菌落表型分析、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析,这4株目标菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)浸泡于菌浓度为1×107CFU/mL的水体中进行48h急性攻毒试验,结果表明,这4株菌对水产养殖动物是安全的。当投放量为1.8×105CFU/mL时,24小时内,对于灭菌养殖废水中的橄榄油(1.96%),4株细菌可将其完全降解；对于不灭菌养殖废水中的橄榄油(1.96%),WC11023、WC11225可将其完全降解,WC11021和WC11041只能将其大部分降解；对于含有普通海水培养基的灭菌养殖废水中的橄榄油(1.96%),WC11021和WC11225可将其大部分降解,而WC11023和WC11041只能将其小部分降解；各菌株的培养上清液对灭菌养殖废水中的橄榄油降解效果都不太理想,仅WC11021和WC11225的上清液能降解小部分油脂。 3.以对人工配合废水(盐度为30)中的COD降解率为指标,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,研究菌株WC11011、WC11148和WC11225复合使用时的最佳配比用量。(1)单因素试验结果表明,在24小时内,当接种量分别为4×104CFU/mL (WC11011)、4×104CFU/mL (WC11148)和1.2×104CFU/mL (WC11225)时,3株菌在16h时对水体COD的降解率达到最大,分别为87.4%、92.5%和65.8%。(2)三因素三水平(以菌株为因素,菌株浓度为水平)正交试验结果表明,3株细菌复合时的最佳配比用量为3×104CFU/mL、4×104CFU/mL和1.2×104CFU/mL,对人工配合废水COD16h降解率为96.4%,极显著高于WC11011和WC11225的降解率(P0.01),显著高于WC11148的降解率(P0.05)。同时,进一步研究了3株细菌及其复合菌24h降解人工配合废水NH4-N和N02-N的能力,结果表明,WC11011、WC11148和WC11225对NO2-N均有明显降解效果,分别为32.6%、67.5%和30.3%；WC11011、WC11148和WC11225对NH4-N的降解率分别为0%、35%和29.1%；复合菌对NH4-N和NO2-N的24h降解率分别为62.9%和81.8%,极显著高于单株细菌的作用效果(P0.01)。