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B.melitensis M5-90及其LPS刺激条件下RAW264.7细胞受CD14影响的miRNAs的作用机制

荣辉  
【摘要】:白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen14, CD14)是参与脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导炎症细胞因子释放的重要分子之一,它也是布鲁氏菌细胞壁主要成分LPS的受体。microRNA(miRNA)是一类非编码的RNA,它参与到生命活动的许多进程中,如细胞增殖、凋亡、病毒防御和细菌感染等。研究表明:CD14基因沉默可以有效抑制LPS刺激条件下肿瘤坏死因子a(TNF-a)、趋化因子配体2(MIP-2)、白细胞介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)的产生。 该研究以本课题组雷明等人构建的mCD14knockdown RAW264.7(224.3)细胞为基础,运用miRNA基因芯片和qRT-PCR技术分析CD14沉默条件下miRNAs的差异表达;利用B.melitensis M5-90LPS刺激224.3细胞,分析B.melitensis M5-90LPS对miRNAs的影响;利用生物信息学软件和Gene Ontology对差异表达miRNAs的潜在靶基因进行预测并分类;利用qRT-PCR. Western blot和双荧光素酶报告基因技术,对B.melitensis M5-90感染224.3细胞后差异变化miR-199a-3p调控靶基因的作用机制进行初步研究。 结果表明:与对照细胞相比,在224.3细胞中,mmu-miR-199a-3p、 mmu-miR-199a-5p和mmu-miR-21-5p表达上调;在B.melitensisM5-90LPS刺激224.3细胞后发现,mmu-miR-199a-3p和mmu-miR-199a-5p表达上调,但与未刺激实验结果相比,mmu-miR-199a-3p的上调水平明显降低;利用四个在线数据库对差异表达miRNAs的靶基因进行生物学预测,并通过Gene Ontology对靶基因进行分类;在B.melitensis M5-90感染224.3细胞后,Cbl-b基因表达下调,在mRNA水平和蛋白水平的验证结果一致;通过荧光素酶实验我们发现,构建含有靶位点的荧光素酶载体与miR-199a-3p模拟物共同转染靶细胞,可以显著抑制萤火虫荧光素酶活性,这些结果初步证实了在B.melitensis M5-90感染224.3细胞内,miR-199a-3p可以靶向调控Cbl-b的表达。这些结论为研究通过抑制上游炎症通路以减弱损伤性炎症反应的作用机理提供了重要信息,同时为探索布鲁氏菌病致病机理提供了重要的理论依据。


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