椰肉发育过程中差异表达基因的分离和功能注释

【摘要】：椰子(Cocos nucifera L.)是世界范围内最具经济价值的热带作物之一。目前,有关椰肉(椰子固体胚乳)发育的分子生物学研究还鲜有报道。为全面了解椰肉发育过程中组织发育和物质代谢的分子机制,本研究通过抑制消减杂交(SSH)文库构建、生物信息学分析和荧光定量PCR验证的方式鉴定了一系列椰肉发育过程中差异表达的相关基因,并对其中进行了功能注释。主要研究结果如下： 1.以三个不同发育时期(授粉后约7个月(Stage1).9个月(Stage2)和11个月(Stage3))的椰肉作为研究材料,利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对椰肉中油脂及各种脂肪酸含量进行分析。结果表明：椰肉在发育早期(9个月以前)快速地积累油脂,后期(9-11个月)积累速度减缓,但是前后时期积累的主要脂肪酸却不一样,最初大量积累C18:2△9,12,之后主要积累C12:0。 2.利用SSH法构建了四个SSH文库,并利用Blast2GO软件对这些差异表达序列进行了功能注释。结果表明：在随机选择的1272个序列的克隆(每个文库约300个克隆)中,有63%的序列与数据库中已知的蛋白质功能类似。通过对文库中阶段特异性表达的序列的GO (gene ontology)id比较分析,筛选得到了6个在椰肉发育过程中持续上调的基因,28个持续下调的基因,28个先短暂性的上调后下调以及9个先短暂性下调然后上调的基因。 3.以KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库为背景分析发现差异表达基因中有溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、磷脂酶D、乙酰辅酶A羧化酶羧羟基转移酶、3-羟基异丁酰基辅酶A水解酶和丙酮酸脱氢酶与脂肪酸的合成和分解代谢途径有关；磷酸丙糖异构酶、纤维素合成酶和1,3-β葡聚糖苷酶与糖代谢途径相关；另外,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)既与脂肪酸代谢有关又与糖代谢相关； 4.从获得的737个非冗余基因中选择了103个阶段特异性表达的基因进行荧光定量PCR的验证。结果显示：SSH文库所得到的序列有效性高达66.6%。 综上所述,本研究通过SSH文库构建和生物信息学分析的方法获得了一系列与椰肉发育过程中组织发育、脂肪酸代谢、糖代谢和次生代谢相关的功能基因。本研究的进行将更好地揭示椰肉发育的调控方式,为最终克隆影响椰肉发育及物质代谢的关键基因,并从分子水平上改良果实发育和成熟特性提供更可靠的理论依据。同时,获得的椰子胚乳组织特异表达基因将为其它物种果实品质的改良提供参考资源。