橡胶树叶片受多主棒孢侵染后的差异表达基因分析及其抗病性相关基因的克隆

【摘要】：近20年来,由多主棒孢(Coiynespora cassiicola)引起的橡胶树棒孢霉落叶病(Corynespora leaf fall disease, CLFD)是继南美叶疫病(South American Leaf Blight,SALB)之后,影响天然橡胶产业最为严重的叶部病害之一,已给主要植胶国造成巨大的经济损失,也成为我国天然橡胶生产最为严重的潜在危险性病害。但,国内外有关橡胶树对该病害抗病机制的研究鲜有报道。本研究在项目组前期工作基础上,通过病害疫情监测与发生情况调查、抗感橡胶品种筛选及其受多主棒孢侵染后的防御酶活性变化和差异基因表达分析,克隆了抗病性相关基因,并对差异蛋白进行了分离和生物功能推测。 病害疫情监测发现,超过92%的监测点都发现了该病的为害,疫情已扩散蔓延至国内主要植胶区,且疫情逐年加重。病害消长动态调查发现,该病一般3-4月出现病情,8-9月病情急剧上升,10-11月达到全年最高峰,后逐步下降；整体发病率和病指呈逐年加重趋势,且很少品种(品系)表现耐病或抗病。 利用室内外四种抗病性筛选方法,对国内46份核心种质进行了抗病性评价,获得了高抗(HR)种质4份,占8.70%,中抗(MR)种质12份,占26.06%,轻感(S)和中感种质各11份,分别占23.92%,高感(HS)种质8份,占17.40%；同时,通过室内离体接种法,对优良橡胶品种云研277-5×高抗种质IAN873杂交后代群体进行了抗病性筛选,高抗(HR)株系(70株)占26.12%。对筛选获得的抗病(IAN873)和感病(PR107)品种受病菌侵染后的防御酶活性测定发现,β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶等防御酶在抗感品种中的活性变化存在明显差异,且抗病品种的防御酶活性变化高于感病品种。 选取EcoRI(8种碱基)和Mse I(12种碱基)共96对选择性扩增引物组合,对抗病(IAN873)和感病(PR107)品种受多主棒孢侵染后的差异表达基因进行cDNA-AFLP分析,共获得560条差异表达片段(TDFs)；其中,306条TDFs为上调表达,占54.7%,254条TDFs为下调表达,占45.3%。对其中的218条TDFs进行了克隆和序列分析,得到有效同源注释和已知功能的有116条,TDFs功能包括初级和次级代谢(占13.79%)、蛋白质的合成(占12.93%)、防御和胁迫(占9.48%)、信号转导(占6.90%)、能量代谢(占6.03%)、蛋白质的降解和储存(占5.17%)、载体和细胞内运输(占3.45%)、未知蛋白和保守蛋白基因(占21.55%)、其他编码蛋白(占20.69%)等8类,功能预测发现有11条TDFs与寄主抗病性相关。进一步对其中的6条TDFs进行qRT-PCR表达模式验证,结果显示其表达模式与cDNA-AFLP分析结果一致。 采用RT-PCR和PCR技术对cDNA-AFLP分析获得的与抗病性相关的TDFs进行基因克隆和序列分析,获得了与NPR家族蛋白具有高度同源性的HbNPRl (KF753695).HAD家族中的酸性磷酸酶HbVSP2.抗病相关基因类似序列NBS-LRR和TIR保守结构域的同源蛋白基因HbRGH2和HbRGA-1等4个抗病性相关基因。通过qRT-PCR进一步分析了4个抗病性相关基因受多主棒孢病菌和茉莉酸甲酯(MeJA).水杨酸(SA)和乙烯(ET)等外源激素诱导后的表达情况,推测所克隆的抗病性相关基因可能参与的抗病信号途径及功能,明确抗病性相关基因在橡胶树中的组成型表达情况。 抗病品种(IAN873)受多主棒孢病菌侵染前后差异表达蛋白的双向凝胶电泳(DIGE)和质谱鉴定结果发现,在所分离获得的32个差异蛋白点中,有16个蛋白点得到了可信鉴定(P0.05),对应出13种差异蛋白。依据其功能,可以分为能量产生和代谢相关蛋白(占31.25%)、防御与胁迫相关蛋白(占37.5%)、碳水化合物合成和转运相关蛋白(占18.75%)、氨基酸转运相关蛋白(占6.25%)、功能未知蛋白(占6.25%)等5类；并鉴定出一些与寄主抗病性相关的关键酶(超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶)和参与能量运输及代谢途径的差异蛋白。