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木瓜蛋白酶的双水相萃取研究

王伟涛  
【摘要】:木瓜蛋白酶由于其水解蛋白的能力较强,且具有较宽的pH和温度适应性,所以在食品、药品、日化等行业有较广泛的应用。因此对木瓜蛋白酶的分离纯化技术进行深入研究,提取高品质的木瓜蛋白酶具有重要的应用价值。而传统提取木瓜蛋白酶的方法都存在一些问题,所以有必要寻找制备高品质、高活性木瓜蛋白酶的新方法。双水相萃取技术(ATPS)是近几年出现的、非常有应用前途的一种新型生物化工分离技术。而目前对木瓜蛋白酶双水相萃取的研究主要集中在PEG/(NH4)2SO4和PEG/磷酸盐双水相系统,PEG/Na2SO4双水相系统、金属螯合亲和双水相系统、离子液体双水相系统萃取木瓜蛋白酶的研究报道甚少,故实验采取这三种双水相系统萃取木瓜蛋白酶,并对效果进行比较。 首先采用PEG/Na2SO4双水相系统萃取木瓜蛋白酶。考察各成相试剂及pH对木瓜蛋白酶活性的影响,研究体系中不同相对分子量PEG、硫酸钠和PEG的质量分数、pH、酶添加量等因素对木瓜蛋白酶在两相体系中分配行为的影响,采用响应面法优化双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分离条件,并进行了实验室规模的放大。结果表明:Na2SO4的质量分数对木瓜蛋白酶分配行为的影响极显著,其次是PEG的质量分数,pH对分配行为的影响不显著。得到的最佳萃取条件为:16.0%(w/w)PEG6000,18.0%(w/w) Na2SO4、pH7.0、酶添加量为1.0mg/g(酶的质量/系统的总质量)。在此条件下,木瓜蛋白酶在两相体系中的分配系数最高可达3.1,可获得木瓜蛋白酶活性回收率82.6%。实验证明:响应面法优化双水相萃取木瓜蛋白酶的条件是可行的,可用于实际预测。 其次利用金属螯合亲和双水相分配技术对木瓜蛋白酶的萃取进行研究。考察不同无机盐及浓度、PEG分子量及浓度、亲和配基的加入量、pH、酶添加量对木瓜蛋白酶分配行为的影响,对不含亲和配基的双水相和含亲和配基的双水相萃取木瓜蛋白酶的效果进行比较,并采用响应面法优化金属螯合亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的条件。结果表明:亲和配基的加入可以提高木瓜蛋白酶在PEG相的分配。响应面实验结果表明:各因素对木瓜蛋白酶提取的影响顺序为:PEG4000质量分数、Na2SO4质量分数、PEG-IDA-Cu(II)添加量、酶添加量、pH。优化得到金属螯合亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳条件为:pH6.50,PEG4000质量分数为17.25%(w/w),PEG-IDA-Cu(Ⅱ)添加量为0.75%(vNa2SO4质量分数为18.0%(w/w),酶添加量为2.501mg/g。此条件下木瓜蛋白酶的酶活性回收率为93.42%,纯化因子1.55,为该体系的放大试验或规模化生产奠定了相应的试验基础,表明金属鳌合双水相分配技术分离木瓜蛋白酶是可行的。 最后采用离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶。首先考察了pH、温度、各成相剂对木瓜蛋白酶活性的影响,其次考察不同离子液体双水相体系、离子液体侧烷基链长度及浓度、酶添加量、pH、温度对木瓜蛋白酶分配行为的影响,采用响应面法优化离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分离条件,并对萃取前后木瓜蛋白酶的结构进行表征。实验得到各因素对双水相萃取木瓜蛋白酶的影响顺序依次为:K2HPO4的浓度、[C4mim]Cl的浓度、酶添加量、pH。得到离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳工艺条件:0.20g/mL的[C4mim]Cl,0.30g/mL的K2HPO4, pH7.0,酶添加量2.0mg/mL,30℃。UV-vis吸收光谱和FT-IR吸收光谱显示,萃取前后木瓜蛋白酶的结构并未发生变化,说明离子液体双水相的萃取萃取木瓜蛋白酶的条件非常温和,为今后进一步研究该体系的放大试验或规模化生产奠定了相应的实验基础。


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