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AtLEC1基因转化橡胶树易碎愈伤组织的研究

王志秋  
【摘要】:农杆菌介导的遗传转化是目前转基因的主要手段。目前在我国有较多关于橡胶树遗传转化的报道,都以橡胶树组织培养体细胞胚发生为基础。体细胞胚发生是许多因素参与调控的复杂过程,总体来讲,橡胶树大多数品系的体细胞胚发生和植株再生率低,大大限制了橡胶树的育种改良。橡胶树易碎胚性愈伤组织具有结构松软易碎、有胚性、有体细胞胚发生能力、生长增殖快、能长期继代培养等优点,适合作为遗传转化的受体。本研究是通过遗传转化的方法,将拟南芥体细胞胚发生关键基因AtLECl转入橡胶树优良品种热研7-33-97易碎胚性愈伤组织中以期提高体细胞胚发生率。本研究通过单因子实验对农杆菌菌液浓度、易碎胚性愈伤组织侵染时间、共培养温度、共培养时间、共培养pH等因素进行处理,优化了遗传转化体系。通过替卡西林和卡那霉素筛选获得了抗性愈伤组织系,抗性胚状体和拟转化植株。通过GUS染色和分子检测,初步认为AtLECl基因已转入橡胶树基因组中。主要结果为:1.通过单因子实验对农杆菌菌液浓度、易碎胚性愈伤组织侵染时间、共培养温度、共培养时间、共培养pH等因素进行处理,确定农杆菌菌液浓度OD600为0.4~0.5最佳,易碎胚性愈伤组织侵染时间在5~8分钟为宜,共培养时间以4天为宜,24~26℃的共培养温度更利于农杆菌介导的橡胶树的遗传转化,pH为5.7时适于橡胶树品种热研7-33-97易碎胚性愈伤组织的遗传转化。2.橡胶树品种热研7-33-97抗性易碎胚性愈伤组织的筛选抗生素为200mg/L替卡西林、75mg/L的卡那霉素为最佳。3.本研究经过筛选共获得25个抗性易碎愈伤组织系,1140个抗性胚状体,6株再生植株,这些材料通过了GUS染色、PCR、RT-PCR分子检测,其中4株经检测为阳性拟转化植株,而且3个转AtLECl基因愈伤组织系胚状体诱导率与对照相比有显著提高。


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