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罗非鱼头磷脂的制备及其体外抑制骨质疏松作用的研究

马婷  
【摘要】:罗非鱼是我国水产行业重点养殖的淡水鱼类之一,其加工产品以冻罗非鱼片为主,在加工过程中产生大量鱼头、鱼皮和鱼骨等下脚料,而罗非鱼头中含有丰富的磷脂成分,可作为水产保健食品的原料进行开发利用。磷脂是细胞膜的基本组成成分,具有抑制炎症、调节血脂、改善记忆、延缓衰老等多种重要生理功能,这些功能与其脂肪酸组成和由磷酸相连的取代基团(含氨碱或醇类)的组成密切相关,因此不同结构和组成的磷脂具有不同的功效。近年研究发现植物与动物磷脂具有治疗骨疾病的生物学作用,本文为了探明罗非鱼鱼头磷脂(tilapiahead phospholipid,TH-PL)的骨质疏松抑制作用,以罗非鱼头为原料,采用硅胶柱层析法分离得到TH-PL,并在细胞水平探讨其对骨形成和骨吸收作用的影响,具体研究内容如下:1.罗非鱼头磷脂的制备与性质、结构鉴定首先,以罗非鱼头为原料,采用溶剂法提取鱼头总脂,总脂通过硅胶柱层析分离得到TH-PL,TH-PL约占罗非鱼头干重的1.52%。其次,通过傅里叶红外光谱分析得知,TH-PL具有磷脂的特征官能团,初步定性所得样品为磷脂。接着,利用气相色谱法分析发现,TH-PL中含有17种脂肪酸,碳原子数分布在14~22之间,其中饱和脂肪酸约占总脂肪酸含量的34.84%,以C16:0为主;单不饱和脂肪酸约占22.05%,以C18:1含量最为丰富。此外,TH-PL中还含有丰富的多不饱和脂肪酸,约占总脂肪酸的38%,其中C18:2 n-6的含量最高,DHA和EPA的含量分别为7.98%和0.51%。最后,通过薄层色谱和液相色谱-质谱联用确认,TH-PL主要由四种磷脂组分组成,分别为磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PC,65.17%)、鞘磷脂(sphingomyelin,SM,17.60%)、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC,11.86%)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamines,PE,2.62%)。其中,PC 主要以 18:0/24:1、16:0/18:1、12:0/24:2、18:0/18:2、18:0/18:1、18:0/22:1、18:0/24:2、22:6/22:6 等分子种组成,SM主要以 16:1/16:0、18:1/24:1、16:0/26:2、16:0/24:1、16:0/18:1、16:0/26:1 等分子种组成,LPC 主要以 16:0、18:1、18:2、18:0 等分子种组成;PE 主要以 22:6/22:6、18:0p/18:l、18:0/20:4等分子种组成。此外,在PC中检测到含有DHA和EPA链的磷脂,其相对含量分别为5.1 1%、0.62%。2.罗非鱼头磷脂对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响为了探讨罗非鱼头磷脂对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响,在体外建立MC3T3-E1细胞成骨模型,并对罗非鱼头磷脂的作用进行了评价。在指标测定过程当中采用倒置相差显微镜观察MC3T3-E1的细胞形态,噻唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)测定 MC3T3-E1 细胞的增殖性,p-nitrophenyl phosphate(p-NPP)法检测细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性,酶联免疫法检测I型胶原蛋白(collagen type I,COL I)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达量,茜素红染色法测定细胞钙结节形成情况。结果发现,与空白对照组相比,加入TH-PL后,细胞形态和生长状态均未受到影响,且对细胞增殖性没有显著的促进作用。但TH-PL显著提高了细胞ALP活性,促进了 COLI和OCN的表达以及细胞钙结节的形成。与空白对照组相比,当培养基中添加的TH-PL的终浓度为100 μg/mL时,ALP、COL I与OCN的表达量分别增加了 56.97%、49.15%、76.73%,成骨细胞的矿化结节率提高了 65.44%。上述研究结果表明,TH-PL对MC3T3-E1细胞增殖没有显著的促进作用,但可显著促进MC3T3-E1细胞分化与矿化。3.罗非鱼头磷脂对破骨细胞形成与凋亡的影响为了探究罗非鱼头磷脂对破骨细胞形成与凋亡的影响,实验采用RANKL诱导RAW264.7细胞分化建立破骨细胞模型,MTT法检测TH-PL对RAW264.7细胞存活性的影响,抗酒石酸性磷酸酶(artrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法评价其对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响,流式细胞术检测其对破骨细胞凋亡的影响,罗丹明123试剂荧光染色法测定破骨细胞线粒体膜电位的变化情况,Western blotting法检测破骨细胞中caspase-3的表达量。结果显示,TH-PL对RAW264.7细胞无毒副作用,而质量浓度为50、100μg/mL的TH-PL能够显著抑制RAW264.7细胞分化为破骨细胞,且能促进破骨细胞凋亡、降低破骨细胞线粒体膜电位以及提高细胞中caspase-3的表达量。与模型组相比,质量浓度为100 μg/mL的TH-PL可使破骨细胞总凋亡率提升至24.17%,细胞线粒体膜电位下降到76.10%。根据以上结果,我们判断TH-PL具有显著抑制破骨细胞形成的作用,并且推测TH-PL是通过线粒体途径诱导破骨细胞凋亡。


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