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橡胶树悬浮细胞有丝分裂同步化及微核诱导研究

吴紫云  
【摘要】:细胞悬浮系具有分散均匀,生长旺盛,细胞内含物充实,易培养,试验重复性好,悬浮细胞系取材方便,不受季节和环境条件的限制等优点,已成为原生质体培养、细胞融合、外源基因转化及细胞突变体筛选的极好材料。本实验系统研究了橡胶树悬浮细胞培养的培养条件,建立了橡胶树细胞悬浮体系及其再生体系,并利用悬浮细胞进行了悬浮细胞超低温保存、细胞同步化及微核诱导等方面研究,以期为今后橡胶树细胞工程研究奠定基础,其主要结果如下: 易脆花药愈伤组织诱导:将单核靠边期的花药接种到改良的MS愈伤诱导培养基(MMCM)[改良的MS培养基并添加0.1 g/L肌醇、1 mg/L 2,4-D、2 mg/L NAA、1.5 mg/LKT、70 g/L蔗糖、2.2 g/L phytagel和5%CW]上培养40~60 d,取颜色鲜艳的黄色愈伤组织接种到相同培养基上,10 d继代一次,直到形成易脆愈伤组织。 细胞悬浮系的建立:取3 g易脆愈伤组织接种到含20 mL改良的MS悬浮培养液(MMSM)[改良的MS培养基并添加0.1 g/L肌醇、1 mg/L 2,4-D、2 mg/L NAA、1.5 mg/LKT、50g/L蔗糖和5%(v/v)CW]的100 mL三角瓶中,5~7 d继代一次,每次选新形成的细胞接种到新三角瓶中,直至建成稳定的细胞悬浮系。 细胞悬浮系动力学研究:生长良好的细胞悬浮系分散性良好、细胞团较小、内含物丰富、大小均一、生长迅速。动力学研究表明,细胞生长呈S曲线,包含滞后期、指数期、线性期和减速期,悬浮细胞的增长较快,7~12 d培养周期中,增长3~5倍。SCV、FW或FW的GI、EC与DW或DW的GI呈良好的线性关系。 细胞悬浮系继代:稳定后的悬浮细胞培养在优化的培养基(OSM)[改良的MS培养基并添加0.6 g/L肌醇、0.4 g/L CH、0.2 g/L Asn、0.2 mg/L 2,4-D、2 mg/L NAA、1 mg/L KT、50g/L蔗糖和7.5%(v/v)CW]中生长更好,适合长期继代,减少接种量和减慢摇床转速,可以降低接种频率。 悬浮细胞诱导胚性愈伤组织:悬浮细胞接种到悬浮系诱导愈伤组织培养基(SCM)[改良的MS培养基并添加0.1 g/L肌醇、2 mg/L 2,4-D、4 mg/L NAA、70 g/L蔗糖、2.2 g/Lphytagel和5%(v/v)CW]上可诱导出愈伤组织,诱导率达100%;将形成的愈伤组织接种到悬浮系诱导胚性愈伤组织培养基(SECM)[改良的MS培养基并添加0.1g/L肌醇、2mg/L BAP、2 mg/L NAA、2 mg/L GA、70 g/L蔗糖、2.2g/L phytagel和5%(v/v)CW],可形成胚性愈伤组织,诱导率大于30%;形成的白色胚性愈伤组织可以接种到悬浮系胚性愈伤组织增殖培养基(SECPM)[改良的MS培养基并添加0.1 g/L肌醇、0.5 mg/L BAP、2 mg/L GA、1 mg/L KT、70g/L蔗糖、2.2 g/L phytagel和5%(v/v)CW],进行长期继代与增殖,胚性不会丧失。 悬浮细胞超低温保存:取对数期细胞,用预培养液[OSM添加200 g/L蔗糖和5%DMSO]处理1 h后加入超低温保护液[OSM添加200 g/L蔗糖],-200℃预冷冻2 h后直接放入LN,40℃解冻2~3 min,最后接种到SCM上恢复。 悬浮细胞有丝分裂同步化:HU和APH处理后的细胞,其有丝分裂同步化的指数有一定提高,4 mmol/LHU处理24 h,除去HU 12 h时MI最大(34.9%);4μmol/LAPH处理24 h,除去APH 10 h时MI最大(33.8%)。APM处理细胞的同步化效果最好,8μmol/LAPM处理细胞8 h的MI最高(88.2%);ORY和COL次之,4μmol/L ORY处理细胞12 h的MI最高(84.7%),6 mmol/L COL处理细胞12 h的MI最高(59.6%);CIPC对细胞MI影响较小,50μmol/L CIPC处理细胞12 h的MI最高(16.7%)。HU和APH处理,对染色体表观形态无显著影响,而一定浓度的APM、ORY、COL和CIPC可使细胞染色体浓缩和聚集,就APM而言,染色体浓缩和聚集程度与APM浓度呈正相关,浓度愈大,聚集时间愈长,观察到的细胞MI越大。 悬浮细胞微核化:悬浮细胞经混合酶液[5 g/L MES,10 g/L纤维素酶,1 g/L果胶酶,5g/L半纤维素酶,15 g/L离祈酶,130 g/L甘露醇,27.2 mg/L KH_2PO_4,101.0 mg/L KNO_3,1480 mg/L CaCl_2·2H_2O,0.16 mg/L KI,0.025 mg/L CuSO_4·5H_2O,pH 5.8]酶解14 h后分离原生质体的效率较高,纯化后的原生质体大小均匀,细胞质浓厚,活性高。生长良好的对数生长期的细胞经1μmol/L APM处理10 h,去除APM后酶解10 h,有丝分裂中期指数(MI)为39.7%,微核化指数(MNI)为7.3%,平均每个细胞产生微核3.8个。


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