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苦丁茶中的苯丙素苷类药物小分子与蛋白质相互作用的机理研究

沈亮亮  
【摘要】:在生物体中,蛋白质是必不可少的生命物质,在生命的运动和发展中起着重要作用。作为研究对象的血清白蛋白是体内含量最丰富的运载蛋白,胰蛋白酶和脂肪酶存在于胰腺内,且胰蛋白酶在严重的胰腺炎患者体内活性很高,脂肪酶则负责人体膳食中的脂肪代谢,这些人体内的重要转运蛋白和消化蛋白与药物小分子的相互作用能够治疗严重的胰腺炎和肥胖症,且能够更好地帮助我们了解药物在机体的生物代谢过程,本实验还可以对来自草本植物中的苯丙素苷类小分子的有效利用及相容性提供有价值的信息,并对它们在体内的药理学及临床医学有着极其重要的意义。本论文采用紫外可见分光光度法、荧光光谱法、圆二色谱法等光谱学方法,并结合分子模拟技术来研究生理条件下苯丙素苷类小分子紫茎女贞苷A(Ligupurpuroside A)和紫茎女贞苷B(Ligupurpuroside B)分别与牛血清蛋白、胰蛋白酶和脂肪酶相互作用过程,具体研究了它们之间的猝灭类型、结合位点、结合常数、结合力类型和蛋白的构象变化,探索它们之间的相互作用机理。具体如下:通过光谱法和分子对接技术研究了Ligupurpuroside A和Ligupurpuroside B与牛血清蛋白(BSA)的相互作用机理。实验结果表明,这两种小分子均可以猝灭BSA的内源荧光,猝灭类型为以静态猝灭为主的联合猝灭,它们结合到一起形成了基态复合物,且Ligupurpuroside A对BSA内源荧光的猝灭能力大于Ligupurpuroside B。两种小分子均与BSA有一个结合位点,结合常数大,能够被BSA贮存和转运到人体内的靶部位,且Ligupurpuroside A的结合能力大于Ligupurpuroside B。通过热力学计算得到Ligupurpuroside A与BSA的作用是一个焓驱动且放热的过程,作用力主要为范德华力和氢键;Ligupurpuroside B与BSA的结合则是一个弱吸热且熵增明显的过程,在反应中疏水作用力为主要驱动力。非辐射能量转移实验得出Ligupurpuroside A距离BSA的荧光团更近,为2.73 nm。紫外可见光谱、同步荧光光谱和圆二色谱得到这两种小分子均可以导致蛋白肽链松弛,色氨酸周围的疏水性减弱,而酪氨酸周围的疏水性增强,且Ligupurpuroside A更深入的插入到了BSA的疏水腔中。利用计算机模拟技术对小分子和蛋白进行了对接,结果表明这两种小分子均可以插入到BSA邻近Trp 213周围的疏水腔中,导致BSA的内源荧光强度降低,计算出来的自由能变化和结合距离也与实验值相吻合。酶活实验表明这两种小分子(Ligupurpuroside A和Ligupurpuroside B)均可通过竞争性抑制类型来抑制胰蛋白酶的活性,它们有可能成为治疗重度胰腺炎的药物。荧光光谱实验证实Ligupurpuroside A能够以联合猝灭的形式来降低胰蛋白酶的内源荧光,而Ligupurpuroside B对胰蛋白酶则为静态猝灭。热力学实验表明Ligupurpuroside A与胰蛋白酶作用是一个以熵驱动为主的自发过程,疏水作用力为主要驱动力;Ligupurpuroside B与胰蛋白酶则是一个以焓驱动为主的自发过程,静电作用力为主要的推动力。构象实验表明Ligupurpuroside A导致胰蛋白酶的色氨酸残基疏水性减弱,酪氨酸残基疏水性增加;Ligupurpuroside B导致胰蛋白酶的酪氨酸残基疏水性增加。分子对接实验显示Ligupurpuroside A和Ligupurpuroside B结合在胰蛋白酶的疏水腔中,且距离胰蛋白酶中的Trp215和Tyr228很近。采用多种光谱手段和分子对接技术研究了Ligupurpuroside A、Ligupurpuroside B与脂肪酶的相互作用过程。酶活实验显示苯丙素苷类小分子能够以竞争性抑制的形式来抑制脂肪酶的活性,且Ligupurpuroside A的抑制能力大于紫茎女贞B。荧光光谱实验表明这两种小分子能够猝灭脂肪酶的内源荧光,猝灭类型均为静态猝灭。结合参数实验得到Ligupurpuroside A与脂肪酶的结合常数大于Ligupurpuroside B。热力学计算得到Ligupurpuroside A与脂肪酶的相互作用是一个以熵驱动的吸热过程,疏水作用力为主要驱动力,Ligupurpuroside B与脂肪酶的作用是一个以焓熵共同驱动的放热过程,作用力主要为疏水作用力,可能伴有静电力作用。从同步荧光光谱和圆二色谱实验可知,脂肪酶在结合苯丙素苷小分子的时候,其构象并没有发生改变。分子对接实验得到了这两种小分子在脂肪酶上的结合位点及相互作用过程中的氢键和疏水作用力的情况,两种小分子均结合疏水空腔中的活性位点上,并与周围的色氨酸、酪氨酸残基相互影响,从而减弱脂肪酶的内源荧光。


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