人α-唾液腺淀粉酶基因和广西巴马小型猪腮腺分泌蛋白基因5’调控序列的克隆及功能验证

【摘要】：单胃动物不能有效利用饲料中的植酸磷,所以单胃动物的高磷粪便就成为了农业磷污染的主要来源。解决单胃动物高磷粪便污染最佳的途径是在饲喂的饲料中添加植酸酶,但是在饲料加工过程中造成植酸酶的部分活性丧失使得这一方法难以获得令人满意的效果。培育通过唾液腺来自行产生植酸酶的转基因猪将成为解决单胃动物高磷粪便污染的一种新的研究策略和手段。唾液淀粉酶和腮腺分泌蛋白都是唾液腺特异性表达蛋白,且表达丰度都很高。为了构建体内定点表达外源植酸酶的转基因载体,本研究克隆了人α-唾液淀粉酶基因5’调控序列和广西巴马小型猪腮腺分泌蛋白基因5’调控序列,并对其进行功能验证,为生产转植酸酶基因猪的研究奠定基础。 参照NCBI上已经发表的人α-唾液淀粉酶基因5’调控序列(Genbank序列号：M19339.1)和猪腮腺分泌蛋白基因5’调控序列(Genbank序列号：AY197556.1),采用T克隆方法克隆了人α-唾液淀粉酶基因和广西巴马小型猪腮腺分泌蛋白基因5’调控序列。将克隆结果分别送两家公司生物公司测序,测序结果证明序列正确。生物软件分析显示,克隆获得人唾液腺α-淀粉酶5’调控区域大小不同的2个序列,长度分别为1057bp和769bp。与NCBI发表的序列相比出现第136位T碱基缺失和212位G碱基缺失,162位A→C突变和675位C碱基插入；克隆获得的广西巴马小型猪腮腺分泌蛋白5’调控序列长度为475bp,与NCBI上发表的序列相比,同源性为100%。 选取AseI和EcoRI对pEGFP-N1进行双酶切,切掉CMV启动子,然后分别与人α-唾液淀粉酶基因5’调控序列(763bp,命名为AMY763)及猪腮腺分泌蛋白5’调控序列(475bp,命名为PSP)连接,构建成AMY763-pEGFP-N1和PSP-pEGFP-N1表达载体。利用lipofectamine2000把AMY763-pEGFP-N1和PSP-pEGFP-N1载体分别转染小鼠腮腺细胞,观察荧光效果。结果表明两个重组质粒均成功转染进小鼠腮腺细胞,重组质粒PSP-pEGFP-N1成功在小鼠腮腺细胞里表达了pEGFP,证明猪PSP在小鼠腮腺细胞中具有启动子的功能,但AMY763-pEGFP-N1无法在小鼠腮腺细胞里表达pEGFP,证明人α-唾液淀粉酶基因5’调控序列AMY763在小鼠腮腺细胞中没有启动子的功能。 利用体外注射睾丸法将重组质粒AMY763-pEGFP-N1和PSP-pEGFP-N1分别转染性成熟的雄鼠,共注射3次,隔两天一次,然后与雌鼠交配产生F1代。AMY763-pEGFP-N1转染雄鼠共获得F1代小鼠20只,其中5只表现为腮腺处毛发生长缓慢,但测序结果显示未能克隆出AMY763序列。PSP-pEGFP-N1转染的雄鼠共获得F1代9只,PCR检验和DNA序列测序发现有3只为阳性小鼠,证明已经将猪PSP成功转进小鼠体内。 综上所述,本实验成功克隆了人唾液腺α-淀粉酶基因和广西巴马小型猪腮腺分泌蛋白基因5’调控序列,并构建了AMY763-pEGFP-N1和PSP-pEGFP-Nl两个重组表达载体。体外实验初步验证了这两个调控序列的功能。通过睾丸注射法获得了转PSP序列阳性小鼠。本研究为下一步开展转植酸酶基因猪的培育工作奠定了基础。