收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

乳腺表达人IFNα-2b转基因小鼠模型的构建

李辉  
【摘要】:干扰素是人体在遭受病毒或其他病原体侵入时产生的一类细胞因子,除了能抵御病毒感染等功能外,还具有抑制细胞分裂、免疫调控和控制细胞凋亡等重要功能,是治疗病毒性疾病和癌症的最佳药物之一。根据干扰素不同的生物学特性、氨基酸组成和受体类型可分为多种亚型,其中IFNa-2b是目前临床上应用最为广泛的一个,常用于病毒性肝炎和一些癌症的治疗。IFNa-2b基因位于人类第9号染色体的9p21区,编码165个氨基酸。成熟的IFNa-2b蛋白是一种含有5个α[螺旋和2个二硫键的糖蛋白,分子量约为19.6kD。 乙型病毒性肝炎是全球高发性传染病,据统计全球慢性乙肝患者约为3.5亿人,约占总人口的6%,而我国乙肝患者约为1.3亿,占全国总人口的10%。作为抗病毒的有效药物,IFNa-2b的需求量非常大。但目前所有临床应用的重组IFNa-2b均为细菌生产,因缺乏一些必要正确的翻译后修饰和空间折叠,造成了它生物学活性低下,血液中半衰期短,甚至在病人体内产生抗体等缺点。所以利用哺乳动物乳腺生物反应器来大量制备具有完全修饰的高活性的重组人IFNa-2b是最佳选择。本研究拟通过制备重组人IFNa-2b转基因小鼠模型,为利用转基因水牛乳腺生物反应器生产重组人IFNa-2b奠定技术和理论基础。 分别克隆了娟珊牛p-酪蛋白基因的有信号肽(5244bp,3912bp)启动子和无信号肽(5165bp,3855bp)启动子,1166bp,ployA序列,荷斯坦奶牛β-酪蛋白基因有信号肽(5219bp,3887bp)启动子和无信号肽(5160bp,3830bp)启动子,1166bp ployA序列。将克隆得到的8个启动子序列构建成8个启动子检测载体(pEGFP-JS5.2BCNpsig, pEGFP-JS5.2BCNpnosig, pEGFP-JS3.8BCNpsig, pEGFP-JS3.8BCNpnosig, pEGFP-HST5.2BCNpsig, pEGFP-HST5.2BCNpnosig, pEGFP-HST3.8BCNpsig和pEGFP-HST3.8BCN pnosig),转染人乳腺癌细胞系Bcap-37细胞后,在激素的诱导下,可见EGFP基因的表达,表明所克隆的启动子是具有启动活性的。而后,与带6×His标签的IFNa-2b基因和筛选基因Neo相连,构建得到8个乳腺特异性表达载体(pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS5.2BCNnosig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS3.8BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS3.8BCNnosig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pHST5.2BCNsig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo, pHST5.2BCNnosig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo, pHST3.8BCNsig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo和pHST3.8BCNnosig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo)。然后,分别转染人乳腺癌上皮细胞系Bcap-37,筛选得到9个阳性细胞克隆。经荧光定量PCR、Western blot和ELISA等检测发现,转染pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo载体的转基因细胞表达量最高,并且所表达的重组IFNa-2b具有生物学活性。因此,此载体可用于制备转基因动物。 将筛选得到的转基因载体pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo改造去掉Neo基因后,经原核注射法获得转基因小鼠。通过PCR和Southern blot对转基因小鼠进行检测。并对整合拷贝数,整合位点以及转基因载体在不同小鼠代数体内的甲基化状态进行了检测。发现所获得的3只转基因Founder小鼠中分别约整合了3-6个拷贝,并在小鼠基因组的4个染色体上的共检测到7个整合位点,分别为5号染色体一个,位于:长臂上NT166301.1位置处;6号染色体上两个,分别为:短臂上的NW001030811.1和NT039353.7位置处;9号染色体上两个,分别为:短臂上NW001030922.1和NT039482.7位置处;17号染色体上两个分别为:短臂上的NT039649.7和NT166301.1位置处。从各整合位点的碱基组成看,断裂结合处均为富含AT区。随着小鼠的传代,转基因载体中CMV启动子的甲基化程度逐渐升高分别从Founder小鼠的79.3%,F1代83%,F2代85.7%,升高至F3代的93%,到F4代高达95.7%。利用RT-PCR, Western blot, ELISA和免疫组化等技术对转基因小鼠乳腺组织检测发现,在泌乳期转基因小鼠的乳腺组织中有IFNa-2b mRNA的转录,但是在乳腺组织外检测不到表达,说明所构建的载体是具有乳腺组织特异性的;对转基因小鼠的乳汁检测发现,乳汁中含有重组的人IFNa-2b,并且融合表达了His标签。利用ELISA法对乳汁中重组人IFNa-2b的含量检测发现,转基因小鼠乳汁中最高表达量约为30μg/L。小鼠乳腺组织的免疫组化检测结果进一步证明了重组IFNa-2b的表达。 为建立一套重组IFNa-2b生物活性的测定方法,克隆了人MxA基因含有3个ISRE元件的启动子,经过活性测定后,构建了pGL3-Mxp3表达载体,与pRL-TK按1:1比例混合后转染WISH细胞,用标准品IFNa-2b处理细胞后,制备了RLU与IFNa-2b活性单位的标准曲线和回归方程。根据在WISH细胞中添加转基因小鼠乳汁获得的RLU的值,计算出活性单位,约为255.85IU,相对比活度约为2.8×107IU/mg。同时利用荧光定量PCR技术对转基因小鼠乳汁中重组人IFNa-2b诱导下游基因的表达量变化进行了测定。共检测了8个候选基因,分别为MxA、OAS、PKR、 Caspasel、p21、MAPK、MHCI和PD-1。检测结果发现,转基因小鼠乳汁能显著提高MxA, OAS, PKR和Caspasel的表达,表达量相分别为非转基因小鼠乳汁的150倍、10.72倍、6.4倍和3.5倍。而p21、MAPK、 MHC I的表达量无明显变化,证明转基因小鼠乳腺表达的重组人IFNa-2b具有生物活性。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 杨东亮;林永利;;干扰素的研究进展及其在动物临床中的应用[J];福建畜牧兽医;2009年01期
2 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1986年08期
3 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1989年07期
4 郭定宗;祝海宝;;干扰素研究进展及在兽医临床上的应用[J];养殖与饲料;2006年02期
5 曹汉威;干扰素[J];养禽与禽病防治;1983年04期
6 林建新,侯云德,段淑敏;两种不同敏感性人细胞干扰素基因组成的比较研究[J];遗传学报;1984年02期
7 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1985年06期
8 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1987年12期
9 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1988年07期
10 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1988年11期
11 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1989年05期
12 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1989年09期
13 侯引绪;;简述干扰素作用机理及在兽医临床上的应用[J];当代畜禽养殖业;2000年11期
14 赵明军;闫若潜;韩记用;吴志明;;猪α干扰素研究进展[J];畜禽业;2008年01期
15 韦莉;王菁;刘爵;;干扰素在禽病防治中的应用[J];中国家禽;2010年09期
16 ;淋巴因子和干扰素[J];生物技术通报;1986年05期
17 刘剑锋;王立贤;张沅;苏振环;;猪干扰素基因研究进展及其在抗病育种中的应用展望[J];北方牧业;2007年05期
18 夏春,汪明,朱凌云,刘津,吴志光,郭玉璞;惠阳胡须鸡IFN-α基因克隆和序列分析[J];畜牧兽医学报;2000年06期
19 任桂萍;裴福成;李景鹏;王君伟;;鸭-干扰素在昆虫细胞中的表达[J];中国兽医杂志;2006年11期
20 赵明军,谌南辉;禽类干扰素基因序列研究进展[J];畜禽业;2002年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 曾曙光;吴世卿;张积仁;章锦才;;mtHSP70/EGFP双基因减毒沙门菌真核共表达载体的构建与表达[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年
2 李娟;张西臣;许应天;;牛瑟氏泰勒虫pMV361-p33-EGFP的构建[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
3 王先良;王春辉;江艳;王小利;杨怡姝;满江红;王菲菲;张金良;;基于EGFP报告基因的去甲基化表观遗传毒性评价新方法[A];中国毒理学会环境与生态毒理学专业委员会第二届学术研讨会暨中国环境科学学会环境标准与基准专业委员会2011年学术研讨会会议论文集[C];2011年
4 关继羽;张鹏;宋光启;刘丽梅;王中伟;唐博;陈育新;李子义;;抗菌肽V13KL与EGFP共表达载体的构建及在COS-7细胞、小鼠胚胎中表达的初步分析[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
5 任艳萍;黄章虎;刘庆友;石德顺;;水牛乳腺特异性表达PRL基因载体构建与表达检测[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
6 杨桂香;彭险峰;曾振灵;;检测雌激素类化合物的哺乳动物细胞表达载体的研究[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
7 罗一博;张力;武美玲;朱江;刘忠华;;PiggyBac转座子介导EGFP在猪体细胞和克隆胚胎中的表达[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
8 林影;植田充美;田中渥夫;;利用蛋白ZZ将EGFP-Fc融合蛋白固定在酵母细胞表层[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
9 林健清;林财珠;林献忠;;构建hIL10和EGFP基因的双顺反子重组腺病毒载体及其在骨髓间质干细胞中的表达[A];中华医学会疼痛学分会第八届年会暨CASP成立二十周年论文集[C];2009年
10 ;Establishment and characterisation of lfabp-EGFP-LC3 transgenic zebrafish:an in vivo model system to study autophagy in liver[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李辉;乳腺表达人IFNα-2b转基因小鼠模型的构建[D];广西大学;2012年
2 刘中华;不同茎部长度shRNA对模型小鼠EGFP基因表达干扰的研究[D];西北农林科技大学;2011年
3 梅恒;组织因子靶向性蛋白纳米粒的制备及其在抗血栓治疗中的应用[D];华中科技大学;2010年
4 刘志滨;腺病毒介导人促红细胞生成素在兔乳腺高效表达的研究[D];西北农林科技大学;2009年
5 赵馨;T-大颗粒淋巴细胞白血病临床特点及疗效IFN-γ在造血调节中的作用[D];中国协和医科大学;2010年
6 魏荣;两种重组火鸡疱疹病毒rHVT-gB1/EGFP和rHVT-EGFP的构建[D];南京农业大学;2001年
7 殷慧群;猪诱导性多潜能干细胞的建立[D];安徽农业大学;2010年
8 肖安东;防御素Defcr4和Mcp-1基因在牛乳腺中表达的研究[D];吉林大学;2005年
9 胡玉荣;PEG化免疫脂质复合物(PILP)介导双基因对实验性人肝癌的靶向性治疗研究[D];郑州大学;2010年
10 王恒毅;乙型肝炎病毒X基因促进肝卵圆细胞增殖及其分子机制的研究[D];华中科技大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈娜;HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立[D];吉林大学;2010年
2 刘雷;Bcr启动子驱动EGFP表达转基因小鼠的制备和初步鉴定[D];扬州大学;2010年
3 严国权;芯片探针杂交效率的影响因素分析[D];浙江理工大学;2010年
4 王付龙;NF-κB反应性d2EGFP报告系统的建立与应用[D];第三军医大学;2002年
5 赵丽静;VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型HIV-1慢病毒载体的构建及表达[D];吉林大学;2011年
6 左广锋;辣椒平对人超极化激活的环核苷酸门控通道亚型2(hHCN2)和亚型4(hHCN4)的影响[D];南京医科大学;2011年
7 陈中湘;反义RNA对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用研究[D];中南大学;2010年
8 周杨;重组人酸性成纤维细胞生长因子乳腺特异表达载体的构建及其功能的验证[D];吉林大学;2011年
9 郭瑞娟;阴道毛滴虫病毒转染载体的构建及EGFP在阴道毛滴虫内的表达[D];吉林大学;2007年
10 黄波;TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育及转基因eGFP表达的影响[D];东北农业大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者  束洪福 通讯员  李继保 陈昌航;我国首批克隆牛再克隆成功[N];科技日报;2005年
2 副主任医师 李华;使用干扰素应注意什么[N];卫生与生活报;2004年
3 杨明亮;蔬菜:吃生还是吃熟[N];山西科技报;2004年
4 本报记者 赖仁琼;编织美好生活[N];人民日报海外版;2002年
5 何长萍;向生吃蔬菜要健康[N];中国石油报;2004年
6 ;现在福州装电话优惠措施有哪些?[N];通信信息报;2001年
7 本报记者 赵雪 周清春 主任 侯云德院士;参透病毒:从基因下手[N];科技日报;2005年
8 汪维;药物制剂研发亟待“革命”[N];中药报;2001年
9 本报记者 孙晨;医药高新成果专场推介会精彩纷呈[N];中国高新技术产业导报;2002年
10 通讯员纪和春记者王建高;转基因体细胞克隆奶山羊诞生[N];科技日报;2002年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978