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乳腺表达人IFNα-2b转基因小鼠模型的构建

李辉  
【摘要】:干扰素是人体在遭受病毒或其他病原体侵入时产生的一类细胞因子,除了能抵御病毒感染等功能外,还具有抑制细胞分裂、免疫调控和控制细胞凋亡等重要功能,是治疗病毒性疾病和癌症的最佳药物之一。根据干扰素不同的生物学特性、氨基酸组成和受体类型可分为多种亚型,其中IFNa-2b是目前临床上应用最为广泛的一个,常用于病毒性肝炎和一些癌症的治疗。IFNa-2b基因位于人类第9号染色体的9p21区,编码165个氨基酸。成熟的IFNa-2b蛋白是一种含有5个α[螺旋和2个二硫键的糖蛋白,分子量约为19.6kD。 乙型病毒性肝炎是全球高发性传染病,据统计全球慢性乙肝患者约为3.5亿人,约占总人口的6%,而我国乙肝患者约为1.3亿,占全国总人口的10%。作为抗病毒的有效药物,IFNa-2b的需求量非常大。但目前所有临床应用的重组IFNa-2b均为细菌生产,因缺乏一些必要正确的翻译后修饰和空间折叠,造成了它生物学活性低下,血液中半衰期短,甚至在病人体内产生抗体等缺点。所以利用哺乳动物乳腺生物反应器来大量制备具有完全修饰的高活性的重组人IFNa-2b是最佳选择。本研究拟通过制备重组人IFNa-2b转基因小鼠模型,为利用转基因水牛乳腺生物反应器生产重组人IFNa-2b奠定技术和理论基础。 分别克隆了娟珊牛p-酪蛋白基因的有信号肽(5244bp,3912bp)启动子和无信号肽(5165bp,3855bp)启动子,1166bp,ployA序列,荷斯坦奶牛β-酪蛋白基因有信号肽(5219bp,3887bp)启动子和无信号肽(5160bp,3830bp)启动子,1166bp ployA序列。将克隆得到的8个启动子序列构建成8个启动子检测载体(pEGFP-JS5.2BCNpsig, pEGFP-JS5.2BCNpnosig, pEGFP-JS3.8BCNpsig, pEGFP-JS3.8BCNpnosig, pEGFP-HST5.2BCNpsig, pEGFP-HST5.2BCNpnosig, pEGFP-HST3.8BCNpsig和pEGFP-HST3.8BCN pnosig),转染人乳腺癌细胞系Bcap-37细胞后,在激素的诱导下,可见EGFP基因的表达,表明所克隆的启动子是具有启动活性的。而后,与带6×His标签的IFNa-2b基因和筛选基因Neo相连,构建得到8个乳腺特异性表达载体(pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS5.2BCNnosig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS3.8BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pJS3.8BCNnosig-IFN-JSpA-EGFP-Neo, pHST5.2BCNsig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo, pHST5.2BCNnosig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo, pHST3.8BCNsig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo和pHST3.8BCNnosig-IFN-HSTpA-EGFP-Neo)。然后,分别转染人乳腺癌上皮细胞系Bcap-37,筛选得到9个阳性细胞克隆。经荧光定量PCR、Western blot和ELISA等检测发现,转染pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo载体的转基因细胞表达量最高,并且所表达的重组IFNa-2b具有生物学活性。因此,此载体可用于制备转基因动物。 将筛选得到的转基因载体pJS5.2BCNsig-IFN-JSpA-EGFP-Neo改造去掉Neo基因后,经原核注射法获得转基因小鼠。通过PCR和Southern blot对转基因小鼠进行检测。并对整合拷贝数,整合位点以及转基因载体在不同小鼠代数体内的甲基化状态进行了检测。发现所获得的3只转基因Founder小鼠中分别约整合了3-6个拷贝,并在小鼠基因组的4个染色体上的共检测到7个整合位点,分别为5号染色体一个,位于:长臂上NT166301.1位置处;6号染色体上两个,分别为:短臂上的NW001030811.1和NT039353.7位置处;9号染色体上两个,分别为:短臂上NW001030922.1和NT039482.7位置处;17号染色体上两个分别为:短臂上的NT039649.7和NT166301.1位置处。从各整合位点的碱基组成看,断裂结合处均为富含AT区。随着小鼠的传代,转基因载体中CMV启动子的甲基化程度逐渐升高分别从Founder小鼠的79.3%,F1代83%,F2代85.7%,升高至F3代的93%,到F4代高达95.7%。利用RT-PCR, Western blot, ELISA和免疫组化等技术对转基因小鼠乳腺组织检测发现,在泌乳期转基因小鼠的乳腺组织中有IFNa-2b mRNA的转录,但是在乳腺组织外检测不到表达,说明所构建的载体是具有乳腺组织特异性的;对转基因小鼠的乳汁检测发现,乳汁中含有重组的人IFNa-2b,并且融合表达了His标签。利用ELISA法对乳汁中重组人IFNa-2b的含量检测发现,转基因小鼠乳汁中最高表达量约为30μg/L。小鼠乳腺组织的免疫组化检测结果进一步证明了重组IFNa-2b的表达。 为建立一套重组IFNa-2b生物活性的测定方法,克隆了人MxA基因含有3个ISRE元件的启动子,经过活性测定后,构建了pGL3-Mxp3表达载体,与pRL-TK按1:1比例混合后转染WISH细胞,用标准品IFNa-2b处理细胞后,制备了RLU与IFNa-2b活性单位的标准曲线和回归方程。根据在WISH细胞中添加转基因小鼠乳汁获得的RLU的值,计算出活性单位,约为255.85IU,相对比活度约为2.8×107IU/mg。同时利用荧光定量PCR技术对转基因小鼠乳汁中重组人IFNa-2b诱导下游基因的表达量变化进行了测定。共检测了8个候选基因,分别为MxA、OAS、PKR、 Caspasel、p21、MAPK、MHCI和PD-1。检测结果发现,转基因小鼠乳汁能显著提高MxA, OAS, PKR和Caspasel的表达,表达量相分别为非转基因小鼠乳汁的150倍、10.72倍、6.4倍和3.5倍。而p21、MAPK、 MHC I的表达量无明显变化,证明转基因小鼠乳腺表达的重组人IFNa-2b具有生物活性。


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