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人参皂甙Rg3不同构型免疫佐剂作用和抗氧化作用及其机理的研究

韦晓洁  
【摘要】:人参皂苷Rg3(ginsenoside-Rg3)属于原人参二醇型皂苷,是一种从人参(Panax ginseng C. A. Meyer)中分离提取出来的天然化合物。由于其对肿瘤细胞有很强的抑制作用,所以在人医临床被广泛用于治疗各种肿瘤疾病。Rg3在自然界中存在20-C键的两种差向异构体,即20(R)-Rg3和20(S)-Rg3,近年来研究表明两种Rg3异构体在许多免疫活性研究中存在显著差异。因此,本论文通过研究Rg3两种异构体的免疫佐剂作用、抗氧化作用和对巨噬细胞功能的调节作用,研究Rg3两种异构体的免疫学特性,并比较两者间免疫活性的差异。 1Rg3不同构型免疫佐剂作用的研究 目的:采用OVA作为模式抗原,探讨Rg3两种不同构型的免疫佐剂作用和对小鼠Thl/Th2免疫平衡的调节机制。方法:将32只BALB/c小鼠随机分为4组,分别为生理盐水对照组、OVA对照组、OVA+20(R)-Rg3佐剂组和OVA+20(S)-Rg3佐剂组。第一次免疫后,间隔3周再免疫第二次。分别采集一免和二免后第14天小鼠血液,并检测血清IgM抗体水平、IgG及其亚类抗体水平。二免后第14天,所有供试小鼠处死并分离培养脾脏淋巴细胞,RT-PCR法检测OVA抗原刺激后脾淋巴细胞中相关细胞因子的表达;采用MTT法测脾淋巴细胞增殖试验;Western-blot法检测血清中细胞因子的表达。结果:20(R)-Rg3或20(S)-Rg3做为免疫佐剂与OVA对照组相比,均能显著提高小鼠一免和二免后血清中抗OVA特异性IgG及其亚类(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)和IgM水平;促进小鼠脾淋巴体外增殖(P0.05);显著增强细胞因子Interleukin-4(IL-4), Interleukin-10(IL-10), Interferon-y (IFN-y), Interleukin-12(IL-12)以及核转录因子T-bet和GATA-3的表达(P0.05);显著增强血清中细胞因子Interleukin-5(IL-5)和Interferon-γ (IFN-γ)的表达(P0.05)。且OVA+20(R)-Rg3组各项指标均优于OVA+20(S)-Rg3组。结果表明,20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均具有明显的免疫佐剂效应,并且能调节机体Th1/Th2免疫平衡,20(R)-Rg3免疫佐剂效果优于其异构体20(S)-Rg3。 2Rg3不同构型抗氧化作用的研究 目的:用环磷酰胺(Cyclophosphamide Cy)建立小鼠免疫抑制模型,在此基础上应用20(R)-Rg3和20(S)-Rg3处理小鼠,观察20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对免疫抑制小鼠胸腺指数、脾脏指数、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase ACP)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)、一氧化氮(Nitric Oxide NO)、溶菌酶(Lysozyme LZM)、总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity T-AOC)、黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase XOD)、过氧化氢酶(Catalase CAT)和丙二醛(Malondialdehyde MDA)等免疫学和抗氧化指标的影响,探讨20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对小鼠抗氧化能力的调节作用。结果:20(R)-Rg3或20(S)-Rg3均可提高由Cy诱导的免疫抑制导致降低的小鼠胸腺指数、脾脏指数、ACP活性、SOD活性、LZM活性、T-AOC和CAT活性;降低Cy诱导的NO、XOD活性和MDA水平的升高。结果表明,20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均能对抗Cy诱导的小鼠免疫抑制,具有明显的抗氧化作用,20(R)-Rg3抗氧化活性优于其异构体20(S)-Rg3。 3Rg3不同构型对巨噬细胞功能调节作用的研究 目的:体外分析20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对巨噬细胞系RAW264.7(?)乎吸爆发和吞噬活性的影响及诱导鼠源巨噬细胞的细胞因子(IL-10和TNF-α)和Nuclear factor kappa B (NF-κB)分泌的作用。方法:实验一经20(R)-Rg3或20(S)-Rg3预培养的RAW264.7,用二氢诺丹明(Dihydrorhodaminel23DHR)处理后,与粉红色荧光乳胶微球共同培养,由于细胞的呼吸爆发作用可引起细胞内本身不发光的DHR转化为发绿色荧光的诺丹明(Rhodamine ROD),用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜同时测定粉红色荧光(代表细胞吞噬或粘附粉红色荧光微球的数量)和绿色荧光(间接反应了细胞呼吸爆发的力度),以检测20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对巨噬细胞Raw2647呼吸爆发和吞噬活性的影响。实验二以Raw-blue cells作为研究对象,分别加入不同浓度的20(R)-Rg3或20(S)-Rg3(1、10、100μg/m1)以刺激细胞,然后从细胞培养上清中检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达。实验三以不同浓度的20(R)-Rg3或20(S)-Rg3(1、10、100μg/ml)刺激RAW264.7,并收集细胞,用RT-PCR法检测细胞分泌的细胞因子Interleukin-10(IL-10)水平和Tumor necrosis factor-α (TNF-α)水平。结果:20(R)-Rg3能显著提高RAW264.7的呼吸爆发作用和吞噬活性(P0.05),相反,20(S)-Rg3显著抑制了正常RAW264.7的呼吸爆发作用和吞噬活性(P0.05);20(R)-Rg3或20(S)-Rg3刺激细胞内NF-κBB的活化随浓度的不断增大而降低,但不受LPS特异性抑制剂PMB抑制,且20(R)-Rg3刺激细胞内NF-κB的活化程度大于20(S)-Rg3(P0.05);体外20(R)-Rg3或20(S)-Rg3刺激细胞内TNF-a和IL-10的分泌随浓度的不断增大而降低。与20(S)-Rg3相比,20(R)-Rg3能显著刺激细胞内TNF-a和IL-10的分泌(P0.05)。结果表明,20(R)-Rg3可能是通过增强细胞呼吸爆发作用和吞噬作用清除机体内的活性氧自由基,发挥抗氧化作用,但20(S)-Rg3抑制细胞呼吸爆发作用和吞噬作用的机制有待进一步研究。 综上所述,20(R)-Rg3的免疫佐剂作用、抗氧化能力和巨噬细胞调节作用都优于20(S)-Rg3,是一种理想的免疫调节剂。


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