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家蚕核型多角体病毒分子流行病学调查及宿主特异性研究

梁湘  
【摘要】:家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)是家蚕血液型脓病病原,对家蚕幼虫产生致死性的感染,该病是养蚕业常见且危害较大的一种病毒病。广西地处亚热带地区,具有明显的气候优势,过去几年中广西蚕桑业得到迅猛发展,然而,由于养殖密度大,生产期较长,往往容易造成蚕病特别是病毒性传染病的流行。广西几乎每年都会出现BmNPV的流行,而且这些年来由于养殖规模不断扩大以及病原体在养蚕区不断积累,BmNPV流行显示出逐渐加剧的趋势,给广西养蚕业带来了严重的经济损失。为了广西养蚕业的可持续发展,对广西各地BmNPV流行情况进行调查,了解病毒传播特点,将有助于制定相应措施遏制BmNPV在养蚕区扩大化流行。 本研究从广西各养蚕区分别收集了45个野生BmNPV分离毒株,对这些分离株的唯一两个极晚期表达基因多角体蛋白polh基因和微管相关蛋白p10基因进行克隆测序,构建系统进化树。序列分析结果显示,polh基因高度保守,而p10基因变异较大,频繁出现核苷酸点突变,表现出密码子使用多样化,并没有明显的密码子偏好。根据p10基因系统进化树分析,广西BmNPV分离株主要分为三个群clades I、Ⅱ和Ⅲ。广西BmNPV分离株的地理分布显示,clade I(?)口Ⅱ分群中的分离株来源地域较为集中而且毗邻,提示在这些区域内出现局部的流行与传播。cladeⅢ的分离株呈不规律分布于广西各地,提示有可能发生远距离的病毒传播。 广西桑蚕资源丰富,蚕虫或者蚕蛹可以作为一种理想的生物反应器,利用杆状病毒表达系统在其中大量生产重组蛋白,不仅省时省力而且经济节约。狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein, RVG)是主要保护性抗原,能诱导机体产生中和性抗体。本研究使用了一个经过基因工程改良的杆状病毒表达系统,即与BmNPV基因组同源的bacmid缺失了几丁质酶和半胱氨酸酶基因,构建了携带RVG基因的重组bacmid,同时引入在哺乳动物细胞内具有转录活性的巨细胞瘤病毒启动子/增强子CMV-IE序列。将重组bacmid与脂质体混合注射家蚕幼虫血腔,进行体内转染获得重组杆状病毒。鉴定结果显示,重组RVG在蚕虫机体组织中获得大量表达,重组表达的RVG最终定位于细胞质膜,重组RVG分子量略小于在哺乳动物细胞中表达的天然RVG。但是,多个抗RVG单克隆抗体皆与之发生反应,且反应的程度与天然RVG的基本一致,提示重组RVG的结构和功能是完好的。 针对BmNPV宿主特异性研究表明,无论是体内还是体外BmNPV的宿主域相当狭窄。草地夜蛾(Spodoptera frugiperda, Sf)细胞系Sf9一直被认为是BmNPV的非受纳细胞系,BmNPV不能在其中进行有效的复制增殖。本研究中,两个携带有外源报告基因的重组BmNPV,即携带狂犬病病毒RVG基因及巨细胞瘤病毒启动子CMV-IE序列的rBm-PCMV-RVG和携带绿色荧光蛋白GFP基因的rBm-GFP,被构建并表现出对Sf9细胞具有感染性。该重组BmNPV可以在Sf9细胞中复制增殖,被感染的Sf9细胞无明显细胞病变,显示一种无症状温和型的感染状态,并且在被感染的Sf9细胞上可以检测到由低pH值引发的膜融合反应。以重组rBm-GFP接种Sf9细胞,GFP荧光灶形成和子代病毒滴度增加证实了病毒可以从Sf9细胞中出芽。然而,只有在接种病毒量较大时,重组BmNPV才能在Sf9细胞中复制增殖,且增殖过程与其在受纳家蚕细胞系BmN中增殖过程不同;而当接种病毒量较小时,重组BmNPV在Sf9细胞中产生顿挫感染。另外,重组rBm-GFP在Sf9细胞中经过系列传代后显示出比传代前的原始病毒复制能力更强。 根据GenBank发表的家蚕抗BmNPV病毒脂肪酶基因Bmlipase-1和丝氨酸蛋白酶基因BmSP-2序列,分别设计相应引物,以广西优良家蚕品系“两广二号”为实验材料,成功克隆了该品系家蚕两个抗病毒基因的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),测序并与不同蚕来源的同源基因序列进行比较。实验结果显示:“两广二号”家蚕Bmlipase-1基因ORF长度是885bp,编码294个氨基酸,BmSP-2基因ORF长度是855bp,编码284个氨基酸;同源性比较表明二者与其他品系家蚕甚至野蚕和蓖麻蚕的同源序列高度保守,核苷酸和推导氨基酸序列的同源性皆在92%以上,其中Bmlipase-1更为保守,同源性达到99%以上;序列分析发现各种蚕来源的Bmlipase-1基因脂肪酶活化部位(GXSXG,X为任一氨基酸)的氨基酸序列完全一致,BmSP-2基因酶催化三联体(His95, Asp142,Ser236)位点及附近氨基酸序列也完全相同。以上结果说明这两个抗病毒基因在桑蚕遗传进化过程中保持高度一致,提示其可能在机体消化或者免疫防御方面起着重要生理作用。将这两个抗病毒基因连接到原核表达载体pET32a(+),在大肠杆菌BL21中融合表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果显示:这两个抗病毒基因都在大肠杆菌中表达成功,融合表达的Bmlipase-1蛋白分子量约为47kD, BmSP-2的分子量约为42kD,与预期大小一致。


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