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水牛卵泡液蛋白质组学研究

潘秋庄  
【摘要】:本试验以广西沼泽型水牛卵泡液作为研究对象,采用双向凝胶电泳技术结合质谱分析水牛成熟卵泡液及未成熟卵泡液之间蛋白表达的差异。试验共分为三个章节:第一章是建立和优化水牛卵泡液蛋白质的双向电泳体系,第二章是分离和鉴定水牛成熟卵泡液及未成熟卵泡液之间的差异蛋白质,第三章首先去除水牛成熟及未成熟卵泡液高丰度蛋白,然后再进行二者之间差异蛋白质的分离及鉴定。 试验一:通过对蛋白质处理方法、IPG胶条的长度及PH值、上样量等参数进行比较及优化,建立适合于水牛卵泡液蛋白质分离的双向电泳体系。结果显示,经丙酮沉淀法处理得到的水牛卵泡液总蛋白,在24cm、PH4-7的IPG胶条且上样量350μg时可以得到质量较好、分辨率较高的双向电泳图谱,应用Image Master2D platinum软件对图像进行分析检测,可得到将近280个蛋白质点。 试验二:采用前面建立及优化的双向电泳体系,对水牛成熟及未成熟卵泡液总蛋白质进行分离,应用ImageMaster2D platinum软件对二者的凝胶图谱进行匹配分析,得到光密度值差异倍数在3倍以上的差异表达蛋白点25个。以成熟卵泡液蛋白质作为对照组,其中13个蛋白质在未成熟卵泡液中表达上调,6个蛋白质表达下调,2个蛋白质缺失,4个蛋白质在未成熟卵泡液中特异性表达。质谱最终鉴定出10个蛋白质:锌指蛋白674、过氧化物酶-2、溶酶体运输调节因子、驱动蛋白、醛糖还原酶、牛纤维蛋白原晶体结构、转甲状腺素蛋白、核苷二磷酸激酶、α-氨基己二酸半醛脱氢酶、抑制素α链前体。 试验三:首先分别对水牛成熟及未成熟的卵泡液样品进行高丰度蛋白去除试剂盒处理,然后同样采用试验一中已经建立及优化的双向电泳体系,对经过试剂盒处理的水牛成熟及未成熟卵泡液蛋白样品进行分离鉴定,共筛选出21个差异表达蛋白点,其中10个蛋白质在未成熟卵泡液中表达上调,7个蛋白质表达下调,3个蛋白质表达缺失,1个蛋白质在水牛未成熟卵泡液中特异性表达。有4个蛋白点被质谱成功鉴定出来,对应4种蛋白质:硫酸化糖蛋白、纤维蛋白原D片段晶体结构、转铁蛋白、触珠蛋白。 本研究通过建立及优化水牛卵泡液双向电泳体系,为后续卵泡液蛋白质的分离提供良好的试验基础。采用两个试验最终分析并鉴定出一批水牛成熟卵泡液及未成熟卵泡液之间的差异表达蛋白质,为研究水牛卵母细胞的发育微环境及成熟机制提供新的研究线索。


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