巴马小型猪精原干细胞体外分化的初步研究

【摘要】：为研究巴马小型猪精原干细胞(SSCs)的体外分化体系,本研究对巴马小型猪SSCs进行了分离、纯化和鉴定,并初步探索了其在体外诱导单倍体细胞和类胚胎干细胞的方法。. (1)对3～4周龄的巴马小型猪SSCs的分离纯化方法进行了摸索。结果发现,采用胶原酶、透明质酸酶和胰蛋白酶三步酶解法消化猪的曲精细管可以得到大量的睾丸细胞,培养60h后,通过鼠尾胶原Ⅳ和laminin进行差异贴壁法可纯化得到大量A型精原干细胞。用终浓度为15μg.ml-1的丝裂霉素C避光处理STO细胞2h, STO细胞的生长完全被抑制,死细胞较少,适合用作饲养层。 (2)对巴马小型猪SSCs体外培养特征及精原干细胞特性进行了研究。结果发现,将巴马小型猪SSCs接种在STO饲养层上1d之后,SSCs的生长状态良好,呈圆形或椭圆形,在培养了3～5d之后,部分SSCs开始形成小集落和结构紧密的克隆。克隆表达CDH1和UCHL1表面分子标记蛋白,同时也表达猪生殖细胞特有的凝集素蛋白DBA。 (3)从细胞水平和组织块水平对巴马小型猪SSCs的体外诱导分化进行初步研究。结果发现,SSCs在支持体系为睾丸体细胞,培养条件为32℃、5%CO2的培养箱,培养基成分为a-MEM+10%KOSR+RA+IGF+FSH的诱导分化体系下,流式细胞仪检测诱导的细胞可见单倍体峰。但同样的体系并不能支持睾丸组织块诱导分化至精子细胞。 (4)对巴马小型猪睾丸细胞向类胚胎干细胞的诱导转换进行了初步探索,结果显示,在诱导培养基成分为a-MEM+10%KOSR+GDNF时,4d左右可见大小不一的小集落,培养至14d,克隆边缘与周围形成较为明显的界限。克隆呈碱性磷酸酶染色阳性,表达OCT-4. UCHL1抗体。 以上结果表明：(1)三步酶解法可以分离得到3-4周龄的巴马小型猪精原干细胞；(2)巴马小型猪SSCs能在体外分化产生单倍体峰；(3)巴马小型猪睾丸细胞在体外诱导,一定程度上表现类胚胎干细胞特性,可能为睾丸类胚胎干细胞。