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香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定

张树伟  
【摘要】:香水柠檬(Citrus limon (L.) Burm. F.)属芸香科柑橘属常绿小乔木,果实长圆形,无核,成熟后香气浓郁,一年四季都能开花结果,是优良的栽培品种之一。本研究首先确定香水柠檬与其它柠檬品种间的亲缘关系,并根据柠檬基因组特点设计SSR分子标记引物。主要开展香水柠檬无籽机制的相关研究,从香水柠檬雌雄配子体育性、胚胎发育、授粉亲和性调查其无籽的原因,在此基础上通过转录组测序分析并筛选与无籽相关的候选基因,克隆其中3个基因的全长序列,进行生物信息学分析,采用荧光定量方法分析基因的表达模式,构建植物过量表达载体将这几个基因转入烟草,获得转基因植株为基因功能分析奠定基础。主要研究结果如下: 1、采用ISSR和SCoT分子标记对柠檬、莱檬和藜檬共39份资源进行了遗传多样性分析。两种标记扩增条带的多态性相似,聚类分析显示ISSR分子标记和SCoT分子标记都可以将39份资源大致分为柠檬、莱檬和藜檬三个类群,所有广西来源的藜檬种质划分为一组,引进的柠檬种质划分为一组,北京柠檬单独归为一组。在SCoT.分子标记中塔希提莱檬与欧美等引进柠檬品种聚在一起,但在ISSR标记中与小莱檬聚在一起,SCoT分子标记可以将里斯本、尤力克、费米耐劳和菲诺区分开,两种分子标记结果均显示香水柠檬与白花柠檬亲缘关系最近。 2、采用改良卡宝品红染色压片法观察香水柠檬小孢子母细胞减数分裂,未见染色体桥、落后染色体等异常现象,可以形成正常的四分体,胞质分裂为同时型,成熟的花粉为2-核花粉粒。香水柠檬和白花柠檬均为二倍体,花粉粒形态均为球形,平均每花药的花粉数量相似,两个品种花粉的生活力和萌发率,无显著差异。 3、通过石蜡切片技术观察雌配子体发育,胚囊母细胞经减数分裂形成直线排列的四分孢子,其中1个发育成功能大孢子,单核胚囊经第三次有丝分裂形成八核胚囊,在珠孔端2个助细胞和1个卵细胞组成卵器,合点端有3个反足细胞呈品字形排列,中间有1个中央细胞(含两个极核),香水柠檬雌配子体发育属蓼形。 4、对香水柠檬和白花柠檬进行人工授粉试验,香水柠檬自交后切片观察未见胚胎发育,可形成无籽果实;白花柠檬自交后果实有籽;以香水柠檬为父本杂交后果实有籽,说明香水柠檬花粉可育;以白花柠檬为父本杂交后胚胎发育正常形成有籽果实,说明香水柠檬胚囊可育;香水柠檬去雄不授粉可得无籽果实,说明香水柠檬具有单性结实能力。 5、以香水柠檬为母本进行自交、杂交授粉,采集的雌蕊经固定、苯胺蓝染色后,在荧光显微镜下观察花粉生长情况。结果表明,授粉后2-4h花粉开始萌发,白花柠檬的花粉生长良好48h后到达花柱下部,72-96h到达珠孔并完成双受精;香水柠檬自交后花粉可以萌发并伸入柱头组织,但是伸长至柱头下部出现卷曲、膨大、甚至破裂,很少见花粉管伸长至花柱。说明香水柠檬具有很强的自交不亲和性。 6、对香水柠檬自交、杂交和不授粉的柱头/花柱转录组测序后,采用de novo组装到61,224个unigene,平均长度948bp,N50为1457bp,共47,260个注释到Nr、Nt、 Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库。分析3个样品基因的表达差异,在自交样品中有1356个较另外两样品表达上调,其中包括F-box基因CL2009contig1;杂交样品中有757个较另外两样品表达上调,1452个表达下调,下调基因中包括核糖核酸酶基因unigene14715和unigene17211。这些差异基因参与的生物学过程涉及:花粉管生长(GO:009860)、繁殖过程(GO:0022414)、细胞死亡(GO:0008219)和定位功能(GO:0051179)等。 7、克隆核糖核酸酶基因unigene14715和unigene17211全长,分别命名为CIS1、 CIS2; F-box基因CL2009contigl,命名为ClF-box。对比香水柠檬和白花柠檬ClSl基因,发现ClSl基因转录后在两个品种中发生了不同剪接,香水柠檬ClSl基因有一个内含子编码177个氨基酸,而白花柠檬无内含子仅编码118个氨基酸,氨基酸差异将影响蛋白质功能,推测香水柠檬的花粉在白花柠檬雌蕊上亲和可能与ClSl基因的变异有关。基因同源比对分析显示,CIS1、 CIS2基因与茄科植物林烟草、矮牵牛及豆科模式植物蒺藜苜蓿的自交不亲和核糖核酸酶基因亲缘关系较近;ClF-box基因与草莓等蔷薇科植物S位点F-box基因聚为一类。 8、采用荧光定量分析CIS1、CIS2基因和ClF-box基因表达模式,结果显示CIS1、 ClS2基因在雌蕊中特异表达,其中柱头表达量最高,其次是花柱;ClF-box基因在花药中特异表达;3个基因自交授粉后在雌蕊的表达量高于杂交授粉后,CIS1、ClS2基因在自交授粉4h后表达量最大,ClF-box基因在自交授粉3d表达量最大。 9、以In-Fusion试剂构建植物表达载体,通过农杆菌侵染法将CIS1、ClS2基因和ClF-box基因转入烟草,获得转基因阳性植株。10、对柠檬61,224个unigene进行微卫星(SSR)分布特征分析,共检测到13,318个SSRs序列位点,分布于10,628条unigene, SSR出现频率为21.75%。SSR除单核苷酸重复序列外,三核苷酸重复类型最多,二核苷酸重复类型略少于三核苷酸重复类型,共获得1717对扩增产物在80bp~500bp的引物,选择其中15对引物扩增16个柠檬样品,亲缘关系分析结果,与ISSR分子标记和SCoT分子标记的分析结果类似,但SSR分子标记可以区分遗传相似度很高的品种维尔纳、维拉费兰卡和科特狄肯等。


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