收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

ALV实时荧光定量PCR检测方法的建立及重组腺病毒介导的RNAi抑制ALV-J复制的研究

秦丽莉  
【摘要】:J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)是一种最常见的外源性禽白血病病毒,自1999年我国首次从商品代肉鸡中分离得到之后,全国各地相继报道了ALV-J的感染。ALV的感染可能会造成鸡群生长迟缓、产蛋率和受精率等生产性能的降低、肿瘤发生,同时会造成感染鸡的免疫抑制,给我国养鸡行业造成了巨大的经济损失。然而目前还没有一种药物可以治疗或者控制AL,除了净化措施之外,也需要探索一种有效的抗病毒感染的方法。根据GenBank上ALV各亚群的三个主要编码基因gag、pol、env中的保守序列设计了5对特异性引物,分别用于检测蛋白酶PR、反转录酶RT、整合酶IN、表面蛋白基因gp85和穿膜蛋白基因gp37。通过RT-PCR技术扩增出5对引物的目的片段,回收PCR产物进行克隆测序,测序正确后的样品用于制备标准品质粒,10倍系列连续稀释后进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR,建立检测的标准曲线,同时绘制熔解曲线。结果显示,建立的5条标准曲线扩增效率为92.6%-100.5%,相应的相关系数均超过0.994。经过熔解曲线、特异性试验结果分析,设计的5对引物只能扩增出ALV病毒,特异性好;敏感性试验结果显示,可以检测得到一个数量级拷贝数的标准品质粒。说明建立的方法敏感性高,可以用于检测ALV-J病毒各基因mRNA转录水平的试验。试验通过构建重组腺病毒介导的RNAi以研究其在DF。1细胞上抑制ALV-J毒株HG03病毒复制的能力,应用建立的Real-time PCR方法检测病毒PR、RT、IN、gP85和gP37基因的mRNA转录水平和囊膜蛋白gp85的表达水平,经内参GAPDH校正后计算出mRNA相对表达量,与对照组相比判断其RNAi的抑制效果。首先根据GenBank中HPRS103毒株(Z46390.1)以及本实验室所测J亚型毒株HG03 gp85基因保守区域为靶序列,遵循siRNA设计规则,以及载体pHBAd-U6-RFP的要求,设计了三对寡核苷酸siRNA1、siRNA2和siRNA3。为方便连接载体,序列加入EcoRⅠ和BamHI酶切位点。干扰序列连接腺病毒载体后,与骨架质粒在HEK293细胞中进行同源重组,获得的3个重组载体分别命名为pAd-gp85-shRNA1\ pAd-gp85-shRNA2和pAd-gp85-shRNA3,空载体为pAd-N。经测序鉴定正确后,制备重组病毒种子液并测定其滴度,分别达到1.26×1010PFU/mL、1.58×1010PFU/mL和1.26×1010PFU/mL,空载体滴度为2.0×1010PFU/mL。用构建好的重组腺病毒在DF-1细胞上进行RNAi效果的观察。首先测定重组腺病毒感染DF-1细胞的最佳感染复数(the multiplicity of infection,MOI)为500。其次,用500 MOI的重组腺病毒感染长成单层的DF-1细胞,8h后按1×103TCID50的量接种HG03病毒,接种后48h分别用建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测HG03各基因的mRNA相对转录水平。结果显示构建的重组腺病毒载体对HG03各基因都有抑制效果,对gp85基因抑制率为51.6%-82.0%,其中以pAd-gp85-shRNA2的抑制率最高,达82.0%;对其它4个基因的mRNA相对表达量也有所下调,不同的基因下调的幅度不同。IFA检测的结果显示,干扰组的荧光强度明显弱于阳性对照组的,而空载体对照组与阳性对照组的荧光强度没有明显区别,结果与Real-time PCR检测的相符。本研究成功构建了重组腺病毒介导的ALV-J HPRS103 gp85基因的RNAi载体,通过在DF-1细胞上进行的干扰试验结果证实,构建的重组腺病毒干扰载体可有效抑制ALV-J分离株HG03在DF-1细胞上的复制。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 王广文;牛玉娟;胡东方;王彤彤;张振东;吕传卫;屈亚锦;李宁;刘思当;;利巴韦林、病毒灵、黄芪多糖体外抗ALV-J的活性试验[J];中国兽药杂志;2014年05期
2 刘玉洁;常维山;杨宪勇;崔治中;;ALV-J和REV诱导雏鸡胸腺细胞凋亡[J];中国兽医学报;2007年01期
3 李德庆;赵鹏;王鑫;汪晓飞;崔治中;;鸡胚和雏鸡接种ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液的致病性比较[J];畜牧兽医学报;2013年02期
4 孙晴;秦四海;;肉鸡感染REV和ALV-J后生长抑制在血清指标上的体现[J];黑龙江畜牧兽医;2007年11期
5 郭慧君;崔治中;孙淑红;姜世金;;REV和ALV-J感染对肉用型鸡细胞免疫反应的影响[J];中国兽医学报;2007年05期
6 张振杰;刘绍琼;王波;崔治中;张永光;孙淑红;;地方品种皖南黄肉种鸡ALV-J与REV的共感染及其分子变异分析[J];中国农业科学;2011年11期
7 尹逊河;孙晴;李同树;徐淑敏;衣婷婷;;应用PCR从AA肉种鸡鸡胚和1日龄雏鸡体内检测出CIAV和ALV-J[J];中国兽医学报;2007年05期
8 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 刘玉洁;常维山;杨宪勇;崔治中;;ALV-J和REV诱导雏鸡胸腺细胞凋亡[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年
2 刘玉洁;宋桂强;常维山;;ALV-J和REV诱导雏鸡法氏囊细胞凋亡的研究[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 秦丽莉;ALV实时荧光定量PCR检测方法的建立及重组腺病毒介导的RNAi抑制ALV-J复制的研究[D];广西大学;2015年
2 杜杰;广西地方品系鸡ALV的分离鉴定和引发急性纤维肉瘤的ALV-J株感染性实验[D];广西大学;2013年
3 李德庆;鸡胚和雏鸡接种ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液的致病性比较[D];山东农业大学;2013年
4 张振杰;皖南黄肉种鸡ALV-J与REV的共感染及其分子变异分析[D];山东农业大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978