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黑老虎轮斑病的病原鉴定和毒素成分分析及病害防治研究

谢津  
【摘要】:黑老虎是我国一种传统的药用植物,有消肿、解毒、抗癌、治疗跌打损伤等功效。近年来,随着对黑老虎的研究不断深入,使得黑老虎的价值被发现,也使黑老虎的市场需求不断扩大,为了能满足市场需求,在广西和湖南等地对黑老虎进行了规模化的种植。随着黑老虎的大量种植,病害也逐年加重。作者在对广西种植的黑老虎进行病害调查后发现黑老虎轮斑病是黑老虎的一种严重的新病害,从黑老虎种植园中采集患有轮斑病的病叶,开展病原分离、致病性测定和病原鉴定,并对该病原产生的毒素的进行了研究,对拮抗黑老虎轮斑病菌的内生真菌进行了分离和活性菌株进行了筛选,并对其中一株活性最好的菌株进行了初步鉴定、活性化合物的鉴定和活性测定,对黑老虎轮斑病进行了防治试验。结果如下:1、黑老虎轮斑病的病原鉴定对黑老虎轮斑病病斑进行了切片,镜检观察后,发现病斑上有大量的新拟盘多毛孢的分生孢子盘,初步推断新拟盘多毛孢是引起该病害的病原。对患有黑老虎轮斑病的叶片进行病原分离后,主要得到了3类优势真菌:新拟盘多毛孢、炭疽菌和叶点霉。按照科赫氏法则对分离到的代表菌株进行了致病性测定,最终确定HP2菌株是致病菌。对HP2菌株进行形态和分子鉴定后,将该菌鉴定为棒状新拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis clavispora)。2、黑老虎轮斑病菌(HP2菌株)的毒素鉴定将HP2菌株在PDA培养基中培养(30L),培养21d后,采用有机溶剂浸泡提取、乙酸乙酯萃取等手段处理后经旋转蒸发仪减压蒸干得到到粗提物11.6875 g,之后采用活性追踪、正相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱(Sephadex)、薄层色谱法等技术手段,最终分离出了3个毒素,分别为afritoxinone B、afritoxinone A和oxysporone,以oxysporone含量最多。采用针刺法测定了这3个毒素在5种浓度下对寄主(黑老虎)和非寄主(红薯、芒果和羊蹄甲)上的活性。发现oxysporone对黑老虎的伤害最强,在处理叶片9天后,各个浓度均能引起黑老虎叶片出现坏死斑,其坏死斑的面积从21.54-84.33mm~2,其次为afritoxinone B,其坏死斑的面积从4.52-77.62 mm~2,而afritoxinone A活性最弱,仅当浓度大于等于600μg/m L时才能引起黑老虎叶片出现坏死斑,其坏死斑的面积从2.13-36.92 mm~2。并且这3个毒素对3种非寄主植物也能产生毒害作用。结果表明,毒素oxysporone是黑老虎轮斑病菌的主要致病因子,分离到的三种毒素都属于非寄主专化型毒素。3、筛选对黑老虎轮斑病具有拮抗作用的内生真菌及其活性物质鉴定采集健康的黑老虎器官,分离了698块健康的黑老虎组织块,纯化出220株内生真菌,采用对峙培养法筛选活性菌株,得到15株中具有较强拮抗作用的内生真菌。通过提取其次生代谢产物,采用抑菌圈法进行复筛,选出了一株编号为KCR 23的内生真菌进行了初步鉴定、活性化合物的分离和活性测定。通过形态和ITS序列的比对,将菌株KCR 23初步鉴定为镰刀菌(Fusarium sp.)。将KCR 23菌株在PDA培养基中培养(30L),培养21d后,采用有机溶剂浸泡提取、乙酸乙酯萃取等手段处理后经旋转蒸发仪减压蒸干得到粗提物34.8289 g,之后采用活性追踪、正相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱(Sephadex)、薄层色谱法等技术手段,最终分离得到3个活性拮抗物质,分别为环孢菌素A(cyclosporin A)、环孢菌素B(cyclosporin B)和环孢菌素C(cyclosporin C)。最后采用抑制菌丝生长速率法测定了这3个化合物对HP2菌株的拮抗效果,结果显示cyclosporin A拮抗效果最好,其EC_(50)值为0.0323μg/m L,其次为cyclosporin B,其EC_(50)值为0.1767μg/m L,cyclosporin C活性最弱,其EC_(50)值为0.3026μg/m L,内生真菌及其拮抗物质的挖掘将为黑老虎轮斑病的防治提供新的物质基础。4、黑老虎轮斑病的化学防治试验选择80%代森锰锌可湿性粉剂(WP)、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(WP)、25%嘧菌酯悬浮剂(SC)、45%咪鲜胺水乳剂(EW)、40%苯醚甲环唑悬浮剂(SC)和25%丙环唑乳油(EC)等6种杀菌剂为研究对象,采用抑制菌丝生长速率法测定了这6种杀菌剂对黑老虎轮斑病菌(HP2菌株)的室内毒力,结果发现咪鲜胺的毒力最好,其EC_(50)值为0.0251μg/m L,嘧菌酯的毒力中等,其EC_(50)值为0.6224μg/m L,代森锰锌的毒力最弱,其EC_(50)值为7.2665μg/m L。开展了嘧菌酯与丙环唑和咪鲜胺与苯醚甲环唑进行两两混配后的室内毒力测定,发现嘧菌酯与丙环唑混配时,各个比例均表现为增效作用,且当嘧菌酯:丙环唑为1:9时,增效作用最强;咪鲜胺:苯醚甲环唑仅为1:9时,能产生明显的增效作用,其他比例混配表现出拮抗作用。选择了咪鲜胺、丙环唑和嘧菌酯这3种室内毒力较好的药剂进行了轮斑病的大田防治实验,发现嘧菌酯1000倍液的田间防效最好,在停止施药30 d后,其防效仍高达87.67%,明显优于咪鲜胺1000倍液(防效16.96%)和丙环唑1000倍液(防效54.46%)。综上所述,棒状新拟盘多毛孢是引起黑老虎轮斑病的病原菌,该病原菌在侵染黑老虎叶片后主要产生afritoxinone B、afritoxinone A和oxysporone三种毒素,并且毒素oxysporone是黑老虎轮斑病菌的主要致病因子,同时这三种毒素都属于非寄主专化型毒素。从黑老虎中分离出的内生真菌KCR23对黑老虎轮斑病菌(HP2)有极好的拮抗作用,其产生的环孢菌素A对HP2菌株的拮抗效果最好,其EC_(50)值为0.0323μg/m L。六种杀菌剂中咪鲜胺的室内毒力最好,但大田防治效果不佳,而嘧菌酯的室内毒力一般但田间防效最好。


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